Rhodotorula  aurantiaca 의 phenylalanine ammonia-lyase 활성에 관한 연구

조 대행, 김 의용

서울시립대학교 화학공학과

A study on the phenylalanine ammonia-lyase activity in Rhodotorula aurantiaca

Dae Haeng Cho, Eui Yong Kim

Dept. of Chemical Engineering, Seoul City University

서    론

Phenylalanine ammonia-lyase (PAL)은 L-phenylalanine 을 trans-cinnamic acid 와 암모늄이온으로 전환시키는 비산화적 탈아미노화 반응을 촉매하는 효소로서 주로 효모, 곰팡이, 방선균, 식물조직체(감자의 덩이 줄기, 해바라기 잎, 오이, 겨자, 옥수수 조직) 에 의해 생합성된다.[1]

PAL은 초기에는 주로 L-phenylalanine 분해대사에 관한 연구가 많이 행하여져 왔는데 L-phenylalanine 대사장애 때문에 일어나는 phenylketonuria증을 치료하는데 효과가 있으며, 종양치료제로서도 유효한 치료용의 효소로 보고되기도 하였다. 이 밖에 PAL은 flavonoid, chlorogenic acid 등의 생합성에도 이용되며 상처부위에 생화학적 변화를 일으키게 하는 기능도 가지고 있다.[2]

PAL은 아미노산의 생합성과 분해 사이를 연결해 주는 중요한 열쇠역할을 수행하는데, NH3나 에너지를 발생시키는 이화경로에 있어서 핵심적 효소로서의 기능을 수행하고 필수적 phenylpropanoids의  합성을 일으키는 효소로서의 기능도 수행한다. 최근에는 "aspartame" 의 제조원료인  L-phenylalanine의 수요가 증가함에 따라 trans-cinnamic acid 로 부터 L-phenylalanine을 합성하는 공업적 생산에도 사용되고 있어 날로 그 관심이 증가되고 있다[3].

미생물에 의한 PAL의 생성은 배양조건 특히 영양원의 조성에 따라, 또는 여러 요인들에 의해 크게 영향을 받는데, 이는 세포의 physiology 에 직접적인 영향을 주게 되므로써 세포의 상태를 결정하기 때문이다.

따라서 본 연구의 목적은 phenylalanine ammonia-lyase(PAL) 를 생합성하는 Rhodotorula aurantiaca 를 이용하여 최적의 PAL 활성을 얻을 수 있는 배지 조성 및 기타 배양조건을 최적화하고, 생합성된  PAL 의 동특성을 검토하는데 있다.

L-phenylalanine                       trans-cinnamic acid + NH4+

(C6H5CH2CH(NH2)COOH)        ↑              (C9H8O2)

PAL

Fig. 1 Reaction mechanism of phenylalanine ammonia-lyase

재료 및 방법

사용균주 : Rhodotorula aurantiaca A K-505 는 낙엽수에서 분리하여 한국 생명과학 연구소에서 동정되었다.

배지 및 배양조건 : 종균배지로는 YM 배지( glucose 1%(w/v), peptone 0.5%(w/v), yeast extract 0.3%(w/v), malt extract 0.3%(w/v)) 를 사용하였고, 효소 생산 배지로는 KH2PO4 0.1%(w/v), MgSO4 0.05%(w/v), CaCl2 0.01%(w/v), NaCl 0.05%(w/v) 에 탄소원과 질소원의 종류와 농도를 변화시키면서 사용하였다. 모든 실험은 22 ℃, pH 6.0 에서 진탕배양하였고 배양시간은 각 배지에 따라 초기 정상기에 도달하는 시점으로 하였다. 균체량은 배양액을 증류수로 100배 희석한후 Spectrophotometer 로 660 nm 에서 측정하였다.

효소활성 측정 : 배양액 1 ml 을 12,500 rpm 에서 5 분간 원심 분리하여 회수한 균체를 0.9% 차거운 생리 식염수로 2회 세척하고 0.01% cetylpyridinium chloride 를 함유하는 50mM Tris-HCl 완충 용액 (pH 8.8) 2.5ml 에 현탁시킨 후 25 mM L-phenylalanine 용액 2.5ml 을 첨가하였다. 이 반응액을 30℃ 에서 30분간 반응시킨 후 6 N HCl 0.5ml 을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 상기 반응액을 원심분리 (12,500rpm, 5분) 한 후 상등액을 취하여 Spectrophotometer 를 사용하여 278 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

활성 측정은 trans-cinnamic acid 를 위와같은 순서에 의해 행하여 얻은 표준곡선에 의해 측정하였다. L-phenylalanine ammonia-lyase (PAL) 의 1 unit 는 분당 생성된 1□mole 의 trans-cinnamic acid 로 정의하였으며, 1 unit 의  specific activity는 분당(min), 생균체당(mg) 생성된 1□mole 의 trans-cinnamic acid 로 정의하였다.

결과 및 토론

탄소원의 영향에 대한 실험에서는 glucose, fructose, sucrose 를 각각 0.5%-2.0% 까지 첨가하였을 경우 모두 1.0% 첨가 이후 PAL 활성이 감소하는 것으로 조사되었는데 이 결과로 부터 탄소원은 PAL 유도에 영향을 주지 못하며 오히려 과잉첨가시 PAL의 생합성이 저해받는 것으로 나타났다.(Table 1)

질소원의 영향에 대한 실험에서는 유기 질소원과 무기 질소원을 1.0% 농도로 기본배지에 첨가하여 활성을 측정한 결과 (Table 2) 유기 질소원으로는 tryptone, 무기 질소원으로는 (NH4)2SO4가 가장 높은 활성을 나타내었으며  tryptone 과 다른 질소원을 조합한 결과에서는 그 이상 활성증가는 나타나지 않았다. 또한 균체의 성장과 PAL 생성과는 반드시 비례하지 않았으며 질소원을 제한할 경우 PAL은 유도되지 않았다.

L-phenylalanine은 PAL을 유도하는 아미노산으로 보고되어 있으나 Rhodotorula aurantiaca를 사용한 본 실험에서는 PAL 활성에 영향을 미치지 않았으며 0.1% 이상 첨가시 오히려 활성이 급격히 감소하는 결과를 나타내었다.(Fig. 2)

배양시 초기 pH 가 효소활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 초기 pH를 변화시키면서 PAL 활성의 변화를 본 결과 (Fig. 3) pH 6.0 에서 최대활성을 보였고 그 이외의 pH 에서는 효소활성이 급격히 감소하였다.

효소반응에서의 최적 pH는 8.8 이었으며 7.8-9.3의 범위에서도 90% 이상의 반응활성를 나타내었다(Fig. 4). 또한 동일 조건에서 온도를 변화시키면서 효소의 활성을 측정한 결과 40℃와 50℃의 넓은 범위에서 최대의 활성을 나타내었다.(Fig. 5)

효소반응시 계면활성제인 cetylpyridinium chloride 는 0.01%-0.02% 첨가시 가장 높은 활성을 나타냈으며 0.02% 이상 첨가시에는 활성이 감소하였다(Fig. 6)

Table 1. Effect of carbon sources on PAL activity

addition concentration (%)		Cell growth(mg/ml)	Sp. activity(U/mg min)
glucose	0.5%	4.23	0.096
	1.0%	5.23	0.034
	1.5%	5.41	0.036
	2.0%	5.68	0.036
fructose	0.5%	3.95	0.050
	1.0%	4.38	0.040
	1.5%	4.72	0.045
	2.0%	5.23	0.044
sucrose	0.5%	5.26	0.054
	1.0%	5.94	0.031
	1.5%	6.06	0.041
	2.0%	5.90	0.031

Table 2. Effect of nitrogen sources on PAL activity

Nitrogen sources	Cell growth(mg/ml)	Sp. activity(U/mg min)
peptone	3.70	0.043
yeast extract	3.78	0.029
malt extract	0.87	-
tryptone	3.97	0.646
L-phenylalanine	0.63	-
L-isoleucine	3.14	0.024
L-tyrosine	1.16	-
(NH4)2SO4	2.52	0.549
NH4Cl	2.06	-
(NH4)2HPO4	2.60	-
NH4NO3	1.40	-
none	0.23	-

참 고 문 헌

1. Fritz, R. R., D. S. Hodgins, and C. W. Abell. J. Biol. chem. 251                  (15)4646-4650  (1976)

2. Kalghatgi, K. K., P. V. Subba Rao J. Bacteriol 126(2) 568-578 (1976)

3. Yamada, S., K. Nabe, N. Izuro, K. Nakamichi, and I. Chibata. Appl. Environ.        Microbiol. 42(5) 773-778 (1981)