MSMPR 반응기에서 고분자 전해질에 의한 단백질 침전분리에 관한 연구

김운수(학), 김우식(정), 김용욱(정)

경희대학교 화학공학과

A Study on the Polyelectrolyte Precipitation of Protein

in an Mixed Suspension Mixed Product Removal Reactor

Woon-Soo Kim, Woo-Sik Kim and Yong-Wook Kim

Dept. of Chem. Eng., Kyung Hee University

서 론

단백질 분리공정의 product인 target단백질은 fermentation broth에서 회수되는 경우가 대부분이다. 그런데 이 공정은 target단백질이 broth내에서 유사한 물리, 화학적인 특성을 지닌 여러 가지 또다른 bioproduct와 dilute aqueous mixture를 형성하는 경우가 많고, 회수된 단백질의 activity를 유지해야 하는 분리정제공정 자체의 어려움 때문에 biotechnology plant에서 protein separation operation과 관련된 space, capital, operating cost가 발효자체에 드는 비용보다 훨씬 많이 들고 있는 실정이다.[1,2]

고부가가치의 측면에서 효소의 중요성은 높이 평가되고 있으나 분리정제의 어려움으로 인한 높은 생산가격 때문에 종종 실용화가 저해될 때가 있다. 이 때문에 broth내의 complex mixture로 부터 원하는 단백질을 농축하고 정제하는 것이 downstream processing의 주요목표가 되고 있다. 오늘날에는 사람이 필요로 하는 단백질을 보다 저렴하고 대량으로 생산하 수 있는 기술개발과 아울러 용액으로부터 원하는 단백질을 효율적으로 분리할 수 있는 분리정제 기술개발연구가 활발하게 진행되고 있다. 이중 enzyme product가 회수되는 동안 target단백질의 정제(purification)와 농축(concentration)이 동시에 가능한 방법이 단백질 결정화법(protein precipitation)이다.[3,4]

본 연구에서는 MSMPR(Mixed Suspension Mixed Product Removal) 반응기에서  polyacrylic acid(PAA)에 의한 단백질 결정화법으로 lysozyme을 분리하였다.  이때 반응기내에 투입된 PAA의 첨가량, 분자량 및 동력투입량(power input)의 변화와 같은 결정화 반응조건이 분리된 단백질 입자크기 및 회수율에 미치는 영향을 검토하였다. 그리고 단백질 결정화의 수치해석을 통해 반응조건에 따른 결정화 효율을 예측할 수 있는 실용화를 위한 공학적 기초 연구를 실시하였다.

이 론

단백질 결정화 반응의 수학적인 모델링은  단백질 결정화에 의해 분리된 단백질 입자(aggregate)의 입자크기분포(particle size distribution)를 population balance equation (PBE)으로 묘사하여 나타낸다. 정상상태인 일정한 부피의 MSMPR 반응기에서 입자크기 L의 aggregate에 기초한 PBE는 평균체류시간을 □, 주입용액중에 입자가 없는 조건에서 식(1)과 같이  나타낼 수 있다.[5,6]

[eqn: d(Gn) over dL + n over tau + D + B ~=~0]         (1)

여기서,  n : number density of particles [number/L4t]

G : linear growth rate [L/t]

D : volumetric death rate of particles [number/L4t]

B : volumetric birth rate of particles [number/L4t]

□: mean residence time of precipitator [t]

L : aggregate diameter [L]

를 각각 나타낸다.

식 (1)의 G, D, B의 항들은 다음과 같이 L에 관한 함수로 나타낼 수 있다.

[eqn: G ~= ~G sub o + G sub p ~=~ K sub o L + K sub p over L]       (2)

[eqn: D~=~k sub h L sup beta n]                        (3)

[eqn: B~=~fD(f sup {1 over 3}L)]                     (4)

여기서,  Go : orthokinetic growth rate [L/t]

Gp : perikinetic growth rate [L/t]

Ko : growth rate constant for orthokinetic growth [t-1]

Kp : growth rate constant for perikinetic growth [L2/t]

kh : hydrodynamic death rate constant [L-□/t]

□ : breakage power on L

f : number of equal-volume daughter fragments

를 각각 나타낸다.

식 (2), (3), (4)에서 Ko, Kp, kh등의 model parameter들은 반응기내에 투입되는 고분자 전해질 첨가량, 동력투입량변화등 결정화 반응조건에 따라 달라진다. 따라서 결정화 반응조건과 model parameter와의 상관관계를 알아내면 결정화 반응 종료 후, 반응기내에서의 입자크기 분포를 실험에 의하지 않고도 model parameter 값만으로도 예측할 수 있다.

실 험

고분자전해질에 의한 단백질 결정화는 pyrex 유리로 자체 제작한 1L-4-baffle- Rushton type standard MSMPR 반응기를 사용하여 실시하였고 working volume(VT)은 740ml이었다. 반응기 중앙에 stainless steel로 자체 제작한 six-bladed disk turbine impeller를 사용하여 교반을 실시하였다. 단백질 결정화에 이용한 lysozyme용액은 0.01wt%로 제조한 후, 0.45□m membrane filter로 여과하여 용액 내에 잔류하는 고형물을 완전히 제거시킨 후 정량펌프를 사용하여 반응기내에 투입하였고, PAA용액은 lysozyme과의 비를 고려하여 0.002-0.0005wt%로 제조한 후, 별도의 여과과정 없이  정량펌프를 통하여 반응기내로 투입하였다. Lysozyme과 PAA용액은 모두 용매로 pH 5인 sodium acetate buffer solution을 사용하여 ionic strength가 0.07이 되도록 제조하였고, 용액이 공급되는 동안 flow fluctuation을 방지하고 일정량의 유량이 공급되도록 별도의 by-pass line을 설치하였다. 그리고 MSMPR 반응기내에서 평균체류시간은 10분이 되도록 lysozyme과 PAA 용액의 주입속도를 조절하였다.

단백질 결정화 반응은 먼저 working volume만큼의 증류수를 반응기내에 투입한 후 impeller speed를 고정하였다. 그리고 lysozyme과 PAA용액을 동시에 반응기내에 투입하여 결정화 반응을 개시하였고, 최소 6번의 체류시간(mean residence time)이 경과한 후의 정상상태에서 sample을 채취하여 분석을 실시하였다.

반응 종결 후 분리된 protein aggregate의 mean particle size, particle size distribution은 particle size analyzer(Mastersizer/E, Marvern社)를 이용하여 측정하였고, SEM(Stereoscan 440, Leica社)으로 morphology를 관찰하였다. 그리고 lysozyme 회수율은 lysozyme과 Micrococus lysodekitus cell과의 용해반응에서 초기 투과율의 변화를 M. lysodekitus cell의 농도변화로 전환시켜 얻어진 lysozyme의 초기반응속도로부터 측정하였다.

결과 및 토론

Semi-batch 반응기에 비해 MSMPR 반응기는 정상상태(steady-state)에서 단백질 결정화 반응의 모델링이 이론적인 모델링에 근접하기 때문에, 주어진 반응조건에서 정상상태에 도달하는 평균체류시간(□)을 정하는 것은 모델링 전개상 필수적이다. 일반적으로 정상상태의 도달여부는 평균체류시간에 따른 반응기내의 입자크기의 변화로부터 측정된다. PAA의 분자량이 4,000,000이고 PAA dosage(mass of PAA/mass of lysozyme)가 0.2일 때, 평균체류시간에 대한 단백질 입자크기변화를 동력투입량에 대하여 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1에서 보는 바와 같이 결정화로 분리된 단백질 입자크기는 동력투입량에 관계없이 대략 6□이상에서 일정하게 나타나 정상상태에 도달했음을 알 수 있었다. 이에 본 연구에서는 6□이상의 정상상태에서 결정화 반응을 진행시켜 분석 및 모델링을 실시하였다.

Fig. 2에는 교반에 의해 결정화반응기내에 투입되는 동력투입량에 의한 입자크기의 변화를 PAA dosage에 대하여 살펴본 것이다. 그림에서 보는 바와 같이 결정화된 단백질 입자크기는 PAA dosage가 큰 쪽에서 크게 나타났다. 그러나 PAA dosage가 0.05로 낮은 경우에는 동력투입량에 관계없이 일정한 입자크기를 나타냈지만, 0.1이상인 경우에는 동력투입량에 따라 입자크기가 커지다 점차 감소하는 경향을 나타냈다. 이와 같은 결과는 lysozyme-PAA complex 형성과정에서 PAA dosage의 변화가 complex내에서 lysozyme-PAA간의 결합비율에 변화를 주었고, 동력투입량이 증가함에 따라 입자크기가 큰 쪽에 breakage power(□)가 크게 영향을 미쳤기 때문이다.

참고문헌

1. W. Chen, S. Walker, & J. C. Berg: Chem. Eng. Sci., 47(5), 1039(1992)

2. C. J. Coen, H. W. Blanch, & J. M. Prausnitz: AIChE, 41(4), 996(1995)

3. J. F. Kennedy & J. M. S. Cabral : □ Recovery Processes for Biological

Materials □, John Wiley & Sons, New York(1993)

4. H. V. Iyer, & T. M. Przybycien: Biotechnol. Bioeng., 48, 324(1995)

5. R. R. Fisher, & C. E. Glatz: Biotechnol. Bioeng., 32, 786(1988)

6. C. E. Glatz, M. Hoare, & J. Landa-Vertiz: AIChE, 32(7) 1196(1986)

Fig. 1. The change of particle size with mean residence time

at various power input in MSMPR reactor

( Mw of PAA=4,000,000, PAA dosage=0.2, □=10min )

Fig. 2. The change of particle size with power input

at various PAA dosage in MSMPR reactor

( Mw of PAA=4,000,000, □=10min )