주목나무로부터 Taxol의 용매추출

장경곤, 박영광, 노경호, 정성택

인하대학교 화학공학과

Solvent Extraction of Taxol from Yew Trees

Kyung Kon Chang, Young Kwang Park,

Kyung Ho Row, Sung Taik Chung

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

Taxol ( Paclitaxel ) 은 taxane ring의 구조를 갖는 taxane diterpene amide이다[1]. 이 천연물질은 여러종류의 암 치료에 탁월한 성능을 가지고 있으며, 특히 자궁암, 유방암, 후두암 등의 치료에 효능이 있음이 임상학적으로 증명되었다[2]. Taxol은 세포배양, 합성법 뿐만 아니라 제한된 천연물질로부터 분리·추출되고 있는데, 주요 공급원은 주목나무로부터의 추출물을 제조용 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 것이다.

Taxol은 나무의 연령, 지리학적 위치, 잎의 채집시기, 채집부위 등에 따라 성분이 달라지기 때문에 분리조건이 일정하지 않으며 정확한 분리조건을 예측하기가 어렵다. 이런 문제점을 해결하기 위해 인간의 혈장이나 세포배양의 중간체, 개의 소포체에 존재하는 taxol을 HPLC를 사용하여 분리하거나[3] 사람의 소변에서 taxol을 정량적으로 분리하는 연구가 수행 중이지만[4] 대규모 상업화가 어렵다. Taxus종의 배양액으로부터 taxane을 분리하는데에 있어 HPLC방법과 원심분리방법, membrane등을 사용하여 기존의 방법보다 용매의 양을 줄이면서도 훨씬 신속하고 효율적으로 분리하는 방법이 보고 되었다[5]. 크로마토그래피를 이용한 taxol의 분리는 정상 및 역상의 analytical scale의 많은 연구 이후에 최근에는 제조용 규모의 분리에 대한 실험 결과가 발표되고 있다[6].

본 연구에서는 주목나무로의 추출물부터 taxol의 전처리단계로서 추출 및 정제공정을 확립하는 것이며 이는 제조용 액체 크로마토그래피에서의 조업조건으로 이용될 수 있다.

실험

본 실험에 사용된 표준시약( cephalomannine, taxol, 10 - deacetyltaxol )은 NCI( the National Cancer Institute. Bethesda, MP, USA )에서 제공받았으며, 추출과 정제에 사용된 유기용매는 TEDIA회사의 시약용 hexane, methylene chloride, chloroform, methanol, ethanol, acetone, 1-propanol, isopropanol을 감압여과하여 사용하였다.

추출한 시료를 농축하기 위해 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였으며, 정제공정에서는 open column(150×25 mm)에  silica를 충진하여 사용하였다. HPLC는 Alltech사의 426 HPLC 펌프, 486 검지기(M 7200 Absorbance Detector, 영인과학), U6K 주입기(2□ sample loop)를 사용하였고, 데이터 저장 시스템(data acquisition system)은 Autochrowin(v.1.42, 영인과학)로서 PC에 설치하여 사용하였다.

추출은 임목육종연구소에서 제공한 주목나무 분말을 사용하였다. 완전히 건조한 분말 10 g에 methanol 1□로 24시간동안 추출한 후, 추출액을 농축하기 위해 methylene chloride(MC)로 분배하였다. 추출액 125 □에 methylene chloride 100 □와 물 100 □를 혼합하여 30분간 교반한 후 분별깔대기에서 10시간이상 침강시켰다. 이 공정을 두 번 반복하여 분별깔대기의 하부층(100 □)을 분취하여 회전식 증발기(rotary evaporator, LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)에서 syrup이 될 때까지 농축한다. 이 syrup을 다시 감압식 오븐에서 24시간동안 넣어두고 용매를 완전히 증발시키고, 메탄올을 가하여 100 ppm 시료를 만들었다[8].

주목나무 추출물에 존재하는 lipid, chlorophyl, pigment 등의 불순물을 제거하는 전처리 공정은 매우 중요하며 이후 공정인 크로마토그래피에서 taxol을 보다 쉽고 많은 양을 분리할 수 있게 한다.

용출 이동상은 hexane, methylene chloride(MC), chloroform, acetone, methanol, ethanol, IPA, 1-propanol이고 극성이 낮은 hexane, methylene chloride, chloroform을 기본으로 하여 acetone, methanol, ethanol, IPA, 1-propanol을 2성분계로 조합하여 사용하였다. 용출되는 용출액은 색층(color band)별로 분취하여 제조용 크로마토그래피에서 taxol의 포함여부를 확인하였다. 분석에 사용된 조건은 분석용 scale에서 taxol, cephalomannine, 10-deacetyltaxol의 혼합물을 분리한 조건이었으며[7], column은 silica를 충진시켜 사용하고 이동상은 hexane, IPA, MeOH를 혼합하여 사용하였다. 시료 주입량은 25 □이고, 유속은 1.5 □/min으로 고정하여 일정용매 조성법에서 실험을 하였다. UV 검지는 228 nm에서 고정하였다.

결과 및 토론

Fig. 1는 전처리단계 이전 주목나무 추출물에 대한 크로마토그램이고 standard로서 taxol과 cephalomannine을 Fig. 2에서 확인하였다. 전처리 단계에서 open column에 silica를 충진하고 이동상의 종류와 조성을 변화시키면서 실험하였다. 이동상의 종류에 대한 실험에서는 methanol을 사용한 경우, 4개의 color band를 확인하였으며 이 중 4번째 band에서 taxol을 확인하였다. 이 경우 band의 구분은 명확하지 않았으며 3번 band에서도 미량의 taxol이 용출되었다. Fig. 3에서는 이동상으로 MC와 acetone을 구배용배 조성법으로 한 경우의 얻은 크로마토그램이다. MC/acetone=97/3(vol.%)의 이동상 조성으로 추출액에 함유된 taxane 성분을 open column에 적용시킨 후 MC/acetone=80/20(vol.%)의 조성으로 용출시킨다. Band 4에서 taxol이 확인 되었으며 band 5에서도 미량의 taxol이 있었다.

본 연구에서는 open column에 silica를 충진하고 이동상으로 MC와 acetone을 gradient mode로 사용하여 다량의 불순물을 제거하였다. MC와 acetone은 다른 이동상 조성보다 용출속도가 빠르고 taxol이 함유된 band가 명확하였다.

알림

본 연구는 교육부 생물화학공학 분야연구과제로 수행 중인 project(과제번호 C-6)입니다

참고문헌

1. M. C. Wani, H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon and A.T. McPhail, J. Am.        Chem. Soc., 93, 2325 (1971)

2.  Manfred E. Wolff, "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery", 5th Ed.,     John Wiley & Sons, NY, U.S.A., 1995, p.996.

3. Di Song and Jessie L. S. Au, J. Chromatogr B., 663, 337 (1995)

4. M. T. Huizing, H. Rosing, F. Koopman, A. C. F. Keung and J. H. Beijen, J.        Chromatogr B., 664, 373 (1995)

5. Raymond E. B. Ketchum and Donna M. Gibson, J. Liq. Chromatogr., 16,           2519 (1993)

6. Dauh-Rurng Wu, Klaus Lohse and Hellen C. Greenblatt, J. Chromatogr A., 702,      233 (1995)

7.  장경곤, 노경호, 정성택, 공업화학, 8, 286 (1997)