□-아밀라아제가 고정화된 유기/무기 혼성막 제조와

막반응기로의 이용

장종관, 조규진, 이재석+, 문일식

순천 대학교 공과대학 화학공학과, 전남 순천시 매곡동 315번지

+광주 과학기술원 신소재공학과, 광주광역시 쌍암동 572번지

□-Amylase Immobilization on Organic/Inorganic Hybrid Membrane

and Its Use as a Membrane Reactor

Jongkwan Jang, Gyoujin Cho, Jae-Suk Lee+, Il-Shik Moon

Department of Chemical Engineering, Suncheon National University,

Suncheon, Chunnam, 540-742 Korea

+Department of Material Science and Engineering, Kwangju Institute of

Science and Technology (K-JIST), Kwangju, 506-303 Korea

서론

Membrane bio-reactor는 membrane의 기능과 reactor의 기능을 동시에 수행하는 system을 말한다. 즉 이것은 효소나 세포가 고정화된 bio-membrane을 사용하여 반응기질을 합성 또는 분해 하면서 동시에 분리기능을 수행하는 system이다. 이 system은 효소나 세포같은 bio물질을 사용함으로서 환경오염을 줄일수 있으며 또한 생산과 분리 기능을 동시에 수행함으로서 공정을 단순화 할 수 있어 생산원가를 줄일수 있는 장점을 가지고있다.

현재에는 membrane bio-reactor을 이용하여 산업 폐수중에서 유기물질을 분해하고 정화하는 system의 연구와 membrane bioreactor 를 이용한 tissue type plasminogen activator 생산등의 연구가 진행중이다.1 그러나 이것은 이용하고자 하는 목적에 적합한 membrane의 선택 및 제조 그리고 높은 활성을 유지하면서 효소나 세포를 고정화하는 문제등으로 인하여 많은 어려움을 가지고 있으며, 이로 인하여 효소나 세포의 고정화 방법 그리고 membrane의 재질에 관한 연구가 활발히 연구중이다.2,3

우리는 sol-gel 방법을 이용하여 저온에서 bio-guest 물질을 고정화 할수 있는 bio-compatable 한 유기/무기 혼성 membrane에 효소를 고정화 할경우 장시간 동안 효소의 활성이 유지 되어 질 수 있다는 것에 대한 연구를 최근에 보고 하였다.4 이때 제조 되어진 유기/무기 혼성 bio-membrane은 단단하고 비결정질이며 3차원 구조를 가지는 무기물의 특성과 유기물의 특성을 동시에 함유하여 단단하고 유연한 membrane을 제조 할 수 있었다.4,6

본 발표에서는 sol-gel 방법으로 제조된 유기/무기 혼성 membrane 에 전분을 가수분해하여 고부가 가치인 말토올리고당을 생성하는 □-amylase을 고정화하고, 이 bio-membrane을 사용하여 Fig. 1 에서 보여지는 것처럼 membrane bio-reactor을 제조 하였고 membrane bio-reactor에서 생성된 올리고당들을 UV-vis와 HPLC로 분석하여, 말토올리고당의 생성에 적합한 bio-reactor의 조건을 찿는 것이 목적이다.

Fig. 1. Schematic representaion of the model system used for the

study of membrane bio-reactor

실험방법

□-Amylase가 고정화된 유기/무기 혼성 Membrane제조. 10 % acetic acid 용액 40 mL에 polyvinylalcohol (PVA) 528 mg과 chitosan  160 mg이 완전히 용해 될 때까지 교반하고, 여기에 30 %로 희석된 termamyl (□-amylase) 0.6 mL를 넣고 1시간 동안 교반한다. Tetraethylorthosilicate (TEOS) 1440 mg과 methylmethacrylate (MMA) 2160 mg 그리고 개시제인 AIBN, 3-(trimethoxysilyl)propylmethacrylate (TSM) 480 mg을 ethanol 40 mL에 넣고 5분간 교반 한 다음 이미 제조되어진 chitosan 용액에 교반하면서 천천히 혼합한다. 두 용액을 완전히 혼합한 다음 교반하면서 생긴 기포를 제거하고 glass plate위로 옮긴 다음 50oC에서 gelation한다.

Membrane Bio-Reactor 제조. 제조한 bio-membrane을 Fig.1 에서 보여지고 있는 것처럼 reactor cell사이에두고 SMP23 (EYLA)모델의 미세 펌프를 사용하여 1 % 전분 용액을 공급한다. 시간당 20 mL에서 시간당 100 mL 까지 전분 용액의 공급 속도를 달리하여 bio-membrane이 견디는 정도와 당의 생성 실험을 실행 하였다.

첫 번째 system으로는 reactor cell에 증류수를 채우고 1 % 전분 용액을 공급하며, 두 번째 system으로는 reactor cell에 증류수를 채우지 않고 1% 전분 용액을 공급하였다.

올리고당 분석. UV-vis 550 nm에서 DNS 비색법5에 의하여 당의 생성을 확인하였으며, 확인되어진 올리고당의 분석은 Shimpack CLC-NH2 (M) 칼럼이 부착된 HPLC (Shimazu LC-6AD)를 사용 하였으며, 분석조건은 칼럼온도를 40 ℃로 하고, 이동상으로는 물과 아세토니트릴을 65:35의 비율을 유속 1 mL/min으로하여 RI detector로 분석 하였다.

결과 및 토론

유기/무기 혼성 membrane에 □-amylase를 여러가지 조건하에서 고정화하고 또한 장시간 동안 효소 활성의 안정성을 분석 비교하여 최적의 조건으로 제조된 bio-membrane을 이용4,6하여 Fig. 1의 membrane bio-reactor을 제조 하였으며, 공급하는 반응기질의 속도에 의한  bio-membrane의 한계를 측정한 결과  20 mL/hr 일때 가장 안전하게 수행되어졌다. 따라서 모든 반응조건은 20 mL/hr 고정하여 membrane bio-reactor를 사용하였다.

Reactor cell에 증류수를 채우고 전분 용액을 공급한 system에서는 membrane이 갈라졌으며 채우지않고 한 system에서는 아주 효과적으로 운행 되어 졌으며 모든 결과는 후자의 system에서 생성되어진 sample을 사용 하였다. 시간별로 반응하여 생성된 sample을 UV-vis에의하여 측정한 흡광도를 Fig. 2 에 도시 하였다. Fig. 2에 보여 진 것처럼 약 30시간에서, 당의 생성이 일정하게 되며 이 시간이 지나야 정상 상태로 도달함을 알수있었다. 순수한 Maltose 그리고 반응하여 얻은 당들의 혼합물을 UV-Vis에 의하여 흡광도를 측정한 결과를 Table 1 에 나타 내었으며 Table 1에서 나타 내어진 2차 product는 똑같은 system에서 전분용액대신 1차 product를 공급하여 얻은 생성물을 나타낸다. Table 1에서 보여진 것 처럼 동일한 양의 maltose와의 활성을 비교하여 보면 흡광도가 1차 product가 약 1/20 정도이고 2차 product는 1/6정도이다. 이결과에 기초하면, 전분 용액의 유속( 20 mL/hr )이 너무빨라 완전히 올리고당으로 분해되지 못하고 아닐로덱스트린  상태로 생성 분리 된 것 으로 확인되어진다.

Table 1. Uv-vis absorption of produced oligosaccharides by the                           membrane reactor

	Maltose	1차 Product	2차 Product	Dialysis Cell
흡광도	0.690	0.035	0.120	0.075

2차 Product를 냉동건조 후 wt 8%로 제조하여 HPLC를 분석한 결과 maltose (G2)가 40 %이고 maltopentaose (G5)가 25 %이며 그외의 말토올리고당 (G3, G4, G6, G7)이 35 %가 존재 되어진 것으로 확인 되어지며 결과는 Fig. 3 에 나타내었다.

Fig. 2. UV-vis absorption change of the oligosaccharide

products as s function of time

Fig. 3. HPLC analysis of obtained oligosaccharide products fro m

the reactor.

참고문헌

1. Hyunkoo Kim, Moonsun Ham, Jongsoo Hong, Jinha Lee, Kyungyu Park,       and Hyeonyong Lee, Biotech. and  Bioeng. 1996, 41, 927-936

2. Kiyokazu Imai, Tomoo Shiomi, Kozo Uchida, and Masamitsu Miya, Biotech.     and Bioeng. 1986, 28, 198-203

3. Yoshitaka Gushikem, Ubirajara P. Rodrigues-Filho, Maria do Carmo           Goncalves, and Ricardo C. Cachichi,  Chem. Mat. 1996, 8, 1375-1379

4. Gyoujin Cho, Il-Shik Moon, and Jae-Suk Lee, Chem. Lett. 1997, 577-578

5. James M. Lee, Biochem. Eng., Prentice Hall, 1992, 94-97

6. Jongkwan Jang, Gyoujin Cho, Il-Shik Moon, and Jae-Suk Lee, Theories        and Application of Chem. Eng. 1996, 2, 2671-2674