결정성 chitin 가수분해에 미치는 chitinase의 흡탈착 영향

이은영, 이천우, 이상록, 김 광

동아대학교 화학공학과

Effect of Chitinase Sorption on Hydrolysis of Crystalline Chitin

Eun-Young Lee, Cheon-Woo Lee, Sang-Rok Lee, Kwang Kim

Department of Chemical Engineering, Dong-A University

서론

Chitinase는 달팽이, 콩씨, 곤충, 미생물 등의 다양한 유기체에서 발견된다. 이 효소의 가장 유용한 자원은 미생물로서, 미생물에 의한 chitinase의 생성은  chitin의 생물학적 전환 공정의 한 단계로서 주목을 받아왔다(1). 400여가지의 chitin 가수분해 효소를 생성해내는 곰팡이와 미생물을 조사한 결과 Serratia marcescens QMB 1466은 가장 활성적인 chitinase를 생성했으며, 다른 미생물에 의해 생성된 chitinase가 팽윤된 chitin만을 가수분해하는데 반해, S. marcescens의 chitinase는 □결정성□chitin을 가수분해 한다는 보고가 있다(2). 효소에 의한 가수분해의 경우에, 용해성 기질에 대한 가수분해 기구는 잘 알려져 있는 반면, 결정성 구조의 가수분해에 대한 자료는 상대적으로 적다. 불용성 기질에 대한 효소 반응은 간략하게 나누자면, 고체 표면으로의 확산, 흡착, 촉매반응의 세단계로 구성된다. 이 단계 중, 접근가능한 결정성 기질 표면의 반응 부위에 대한 효소 흡착은 연이어 일어나는 촉매반응에 있어서 필수적인 단계이다. 따라서 본 논문에서는 불용성 chitin과 수용성의 가수분해 염, 효소, 미생물로 이루어진 불균일 계로써 chitinase 생성을 모델화하여, chitinase에 의하여 일어나는 chitin 가수분해에 대한 중요한 물질전달과 반응기구를 확인하고, 이것을 설명하는 변수들을 계산하고자 하였다.

실험재료 및 방법

균주 : Canada British Columbia University의 Biotechnology Laboratory에서 분양받은 S. marcescens QM B1466을 플라스크 배양으로 100mL 배지에서 30℃로 배양하였다. 배양 배지는 YEPD배지(Difco Co. Ltd)를 사용하였으며, 본 배양에서는 pH 8, 30℃에서 0.05% yeast extract, 0.1% (NH4)2SO4, 0.03% MgSO4, 0.136% KH2PO4와 chitinolytic enzyme 생산을 위한 탄소원 1.5% chitin을 첨가한 최소 무기물 배지를 사용하였다.

효소 :  Chitinase 생성은 500□ flask에서 S. marescens QMB 1466을 7일간 배양하여 실행하였다. 효소, 미생물, 분해되지 않은 chitin을 포함하고 있는 최종 발효 broth를 8000rpm에서 20분간 원심분리한 저품 chitinase를 가수분해 실험에 사용하였다.

기질 : 1) 결정성 chitin; SIGMA사(St. Louise MO.)로부터 구입한 결정성 chitin을 ball-mill한 다음, 100mesh와 140mesh 사이로 체에 걸러서 평균 입자 직경이 0.127□가 되게 하였다. 2) Colloidal chitin; Berger등의 방법(3)에 의해, 정제된 chitin을 페이스트 상으로 만들고, glass wool로 여과하여 시럽상 용액을 제조한 다음, 50% 에탄올에 부어서 colloidal chitin으로 침전시켰다.

가수분해 실험 : 1g의 결정성 chitin 분말을 각각 다른 활성을 가진 효소 100□내에서 계속 교반시키면서 반응시켰다. 반응기의 부피는 샘플 채취의 빈도와 크기에 기초하여 250□로 고정하였다. 샘플은 채취한 후, 즉시 원심분리(7500rpm, 5분)하여 chitin 입자와 용액을 분리하였다. 가수분해는 pH 6.6, 30℃에서 실행하였다.

분석 : 효소 활성은 Reissig등의 비색법(4)에 의해 사용된 방법을 따라 540□에서 Micro Elisa Plate Reader(Bio Rad Co. USA.)를 사용하여 측정하였다. Chitinase 1unit는 pH 6, 37℃에서 colloidal chitin으로부터 한시간동안 NAG 1□을 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정하였다.

실험결과

효소 이동론 - Chitin 표면으로의 확산

가수분해 실험에서는, 그림 1에서 나타낸바와 같이, 효소 이동에 관련된 명백하게 구별되는 두 개의 시간 간격이 존재한다. 첫번째는 효소가 chitin 표면상에 흡착되고, 가수분해 반응이 개시되는 동안의 비정상 상태 간격이다. 두번째는 bulk 내에서 효소 농도가 정상상태로 특징지어지는 간격이다. 효소 이동 분석에서, 비정상상태의 초기 부분에 집중하여, 다음과 같은 가정을 한다. 1) 이동은 단일 물질 전달 계수 [eqn: K_L ^O]를 가지는 막이론의 항으로 모델화 할 수 있다. 2) 초기 간격동안, chitin 표면상에는 빠르고 본질적으로 비가역적인 효소흡착이 일어난다. 이러한 현상은 흡착의 초기 시간 동안만 일어난다. 연속방정식을 이용하여, chitin 가수분해에 대한 chitinase 속도식을 다음과 같이, bulk 내의 초기 효소활성과 가수분해 반응후의 활성과의 관계로 나타낼 수 있다.

[eqn: K_L^O = -{(ln E_bo over E_b )}·{1 over a_p} ·{1 over t}]                     (1)

여기서 Ebo는 초기 효소 농도이고, Eb는 시간 t에서의 효소 농도이다.

Table 1은 가수분해 실험 결과를 나타내었다. 초기 효소 활성이 17.14 U/□인 샘플에 대한 자료를 그림 1에 나타내었다. Chitin 입자가 구형이라고 가정하여, ap는 3.41□-1이라하면(5), 각각의 가수분해 실험에 대한 [eqn: K_L^O]의 평균값은 7.25×10-5□/s이 된다.

Table 1. Results of chitin hydrolysis

Eo (U/□) 반응시간(분)	4.48	9.65	11.19	17.14
5	3.37	4.35	9.47	9.92
10	3.42	2.04	7.82	7.94
15	3.26	2.00	6.99	7.90
30	3.26	0.59	6.54	6.29
60	3.76	2.00	5.50	5.69
90	3.39	0.12	5.34	4.12
120	3.05	3.37	4.98	4.55
180	2.05	4.00	4.99	4.55
240	1.99	3.43	4.93	4.78
300	1.92	3.60	4.74	4.64
360	2.51	2.78	4.75	4.65

흡착속도론

가수분해 실험후, 원심분리한 효소 상층액의 활성 E와 초기활성 Eo사이의 차이로부터,  단위 변적당 효소의 흡착능 □(U/□2)을 다음과 같이 계산하였다.

[eqn: □(U/□^2 )= {( E_o -E)} OVER {(mA_s )} V]                        (2)

Fig. 1 Variation of chitinase with       Fig. 2 Chitinase adsorption with time

time during hydrolysis of chitin.          to crystalline chitin.

여기서, m은 chitin 분말의 양(□), As는 chitin의 비표면적(□2/□), V는 상층액의 부피를 나타낸다.

그림 2에 반응온도 30℃에서 결정성 chitin에 대한 chitinase의 흡착능을 나타내었다. 2시간내에 chitin 상에 대한 효소의 흡착능은 최대가 되고, 이후 4시간동안 계속해서 정상상태가 유지된다. 이 결과는 흡착된 효소와 흡착되지 않은 효소 간에 평형 상태가 유지되고 있음을 나타내는 것으로서, 6시간후의 총 흡착 능은 효소의 초기 활성이 4.48, 9.65, 11.19, 17.14 (U/□)일 때, 각각 1.35×10-3, 4.72×10-3, 4.42×10-3, 8.58×10-3 (U/□2)로 나타났다.

효소-생성물 이동

효소에 의한 가수분해 반응시 일어나는 흡착-반응-탈착 기작에 대한 반응기구와 속도식은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

□ 반응기구:  [eqn: E~+~S~REL EXARROW { k}_{a } { k}_{ d} ~ { ES}^{ *} ~~,{ ES}^{ *} Buildrel rarrow k_r~{ EP}^{* }~, { EP}^{ *} Buildrel rarrow k'_d ~EP]

□ 속 도 식:

a. 효소의 흡착 :        RA = ka(E)i[(E*)T-(ES*)-(EP*)]-kd(ES*)          (3)

여기서 (E*)T는 chitin 입자 상에 흡착될 수 있는 효소 분자의 최대 농도를 나타낸다. 따라서, 괄호 안의 항은 반응하는 동안의 활성 표면 농도를 나타낸다.

b. 표면에서 가수분해 반응의 속도 :       RH = kr(ES*)                  (4)

c. 효소-생성물 복합체의 탈착 속도 :      RD = -k□d(EP*)                (5)

준정상상태의 상황 하에서 효소 흡착 속도, 반응 속도, 생성물의 탈착 속도는 같다는 가정하에 다음과 같은 결과를 얻을 수 있다.

[eqn: (ES^* )+(EP^* )= {(E^* )_T (E)} OVER {{( k'_d over k_a )} [{(k_r +k_a )} over {(k_r + k'_a )} ] + (E)}]              (6)

식(6)은 chitin 표면상에 흡착된 효소의 농도와 bulk 상에 존재하는 효소의 농도와의 관계를 나타내는 Langmuir 흡착 등온식의 형태이다. 여기서 아래와 같이하면,

KE=(k'd/ka)[(kr+kd)/(kr+k'd)],        (E*)=(ES*)+(EP*)

Chitin 가수분해 속도와 bulk 내의 chitinase 항으로 흡착된 chitinase와의 관계를  다음과 같이 나타낼 수 있다.

[eqn: 1 over {(E^* )} = {K_E } OVER {(E^* )_T (E) } + 1 OVER {( E^* )_T}]                      (7)

가수분해 실험을 한 flask 전체에 걸쳐서 효소 활성은 거의 일정하기 때문에, 초기 활성과 정상상태 시간대에 나타난 활성의 차이는 chitin 표면상에 흡착된  효소의 양을 나타낸다. 이 차이를 입자표면 ap=3.41□-1로 나누면 흡착된 효소

활성 (E*)를 얻을 수 있다. 식(7)에 따르면, (E)와 (E*)의 값은 그림 3에 이중 역비례 좌표로 도식화하였는데, 이 때, 상관계수는 0.99, 기울기는 2.79□-1이며, 절편은 0.08 □2/U이다. 이 변수들로부터 (E*)T와 KE의 값은 각각 12.5 U/□2과 34.88 U/□로 계산되었다.

Fig. 3 Double reciprotocol plot of concentraion of adsorbed chitinase vs.           concentration of chitinase in the bulk ( T=30℃).

결론

Chitin 가수분해 실험 결과로부터 chitin 가수분해 기작에 대하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 1) Chitin 표면으로부터 분리되는 효소-생성물 복합체의 탈착 속도는 충분해 빨라서 계면내의 효소의 농도는 bulk 효소 농도로 나타낼 수 있다.

2) 표면내의 효소의 농도는 Langmuir 흡착 등온식 형태를 이용하여 bulk 내의 효소의 농도로 나타낼 수 있다. 3) Chitianse system에 의한 chitin 가수분해 속도는 chitin 표면상에 흡착된 chitinase 농도의 선형 함수이다.

참고문헌

1. Tom, R. A. and Carroad, P. A.: J. Food Science, 46, 646(1981).

2. Reid, J. D. and Ogrydziak, D. M.: Appl. Environ. Microbiol., 41, 664(1981).

3. Berger, L. R. and Reynolds, D. M.: Biochem. et Biophysi. Acta., 29, 522.(1958).

4. Reissig, J. L., Strominger, J. L. and Leloir, L. F.: J. Biol. Chem., 217, 959(1955).

5. Young, M. E., Bell, R. L. and Carroad P. A.: Biotech. Bioeng., 27, 772(1985)