Rhodotorula  glutinis로부터 세포외 다당류를 생산하기위한 배양조건의 최적화

조 대행, 김 의용

서울시립대학교 화학공학과

The optimization of culture conditions for the exopolysaccharide(EPS) production

from Rhodotorula glutinis

Dae Haeng Cho, Eui Yong Kim

Dept. of Chemical Engineering, Seoul City University

서    론

다당류는 주로 식물, 동물 및 미생물에 의해 생합성되며, 특히 미생물성 다당류나 이의 유도체는 이미 알려진 식물 및 해조류 유래의 천연다당류나 기타 합성고분자 물질과는 달리 독특한 물성과 생리활성을 나타낸다.

미생물성 다당류에 대한 연구는 1942년 Leuconostoc mesenteroides가 생산하는 dextran이 혈장증량제로 개발된 이래 xanthan gum, pullulan, chitosan, PHB등 여러가지 다당류에 대한 기초연구가 진행되어 왔다.[1] 최근 화학합성고분자 물질의 난분해성으로 인한 환경오염문제를 해결하기 위하여 기존의 합성고분자 제품을 다양한 미생물에 의해 생산되는 체외분비성 다당류와 이의 유도체등으로 대체하기 위한 연구가 진행되고 있다.[2]

미생물성 다당류는 분자량, 구성당의 종류, 결합순서, 결합방식, 결합위치 및 branching 유무에 따라 많은 종류가 존재하는데 이들은 점성을 띠거나 분산을 용이하게 하는 성질을 갖는 물질로서 조건에 따라 gel형성능, 유화안정능, 표면장력의 조절능, 수분 흡수능, 점착능, 윤활능 및 필름형성능 등의 광범위한 특성을 가지고 있어 식품첨가제, 화장품의 보습제, 석유회수 증진제 및 반도체, 의약산업 등에 널리 사용되고 있다.

독특한 물성을 갖는 미생물성 다당류의 생산을 위해서는 발효배지의 조성과 그외 수반되는 환경인자를 고려하여야 하며 이러한 인자들에 의해 생성물의 순도, 화학적 성분과 분자량이 결정된다. 미생물성 다당류는 탄소원과 질소원의 종류 및 그 비율에 의해 크게 영향을 받으며, 온도, pH, 용존산소, 점도 등에 의해서도 그 생산성이 달라진다.[3]

따라서 본 연구의 목적은 자색 효모인 Rhodotorula glutinis를 이용하여 세포외 다당류(EPS)를 생산하기 위한 배지조성 및 기타 배양조건을 확립하고, 생합성된 다당류의 동특성을 검토하는데 있다.

재료 및 방법

사용균주 : Rhodotorula glutinis  K-501은 낙엽수에서 분리되어 한국생명과학연구소에서 동정되었다.

배지 및 배양조건 : 종균배지로는 YM 배지(glucose 10g/l, peptone 5g/l, yeast extract 3g/l, malt extract 3g/l) 를 사용하였고, 다당류 생산배지로는 glucose 30g/l, yeast extract 2g/l, (NH4)2SO4 2g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4 0.5g/l, CaCl2 0.1g/l, NaCl 0.1g/l를 기본배지로 하였으며, 탄소원과 질소원의 종류와 농도를 변화시키면서 사용하였다. 모든 실험은 22℃, pH 4.0 에서 7일간 진탕배양하였으며, 균체량은 배양액을 증류수로 100배 희석한후 Spectrophotometer 로 660 nm 에서 측정하였고, glucose의 분석은 DNS법으로 하였다.

다당류의 분리 및 정제 : 배양액을 증류수로 2배 희석한 후 12,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 2배의 에탄올을 첨가하여 다당류를 침전시켰다. 침전된 다당류는 에탄올로 2회 세척한후 whatman GF/C filter paper로 여과하여 항량이 될 때까지 건조시켰으며, 이 때의 건조중량을 다당류의 생산량으로 하였다.

결과 및 토론

최적 탄소원을 조사하기 위해 기본 배지에 모두 11종의 탄소원을 30g/l로 첨가하여 7일간 배양한 결과 glucose를 사용했을 경우 균체량에 대한 수율이 31%로 다당류 생산성이 가장 높았으며, 이당류인 sucrose와 maltose등도 높은 생산성을 나타냈다.(Table 1)

또한 질소원을 고정하고 glucose의 양을 10g/l에서 100g/l까지 변화시켜 본 결과(Fig. 1) 10g/l의 낮은 농도에서는 다당류가 전혀 생성되지 않았으나, 70g/l일때에는 6.89g/l로 다당류의 농도가 최대가 되었다. 그러나 첨가된 glucose에 대한 수율은 30g/l에서 0.12로 최대값을 보인후 점차 감소하였다. 특히 100g/l첨가시에는 약 30g/l의 glucose가 소모되지 않고 남았으며, 이것으로보아 70g/l이상의 첨가는 균체 증식과 다당류 생산에 저해를 일으키는 것으로 판단된다.

탄소원으로 glucose를 30g/l로 첨가한 배지에 yeast extract와 (NH4)2SO4를 기본 질소원으로하여 그 배합비율을 달리하여 본 결과(Table 2) yeast extract 1g/l에 (NH4)2SO4 2g/l첨가시 다당류 생산량이 가장 많았으나, (NH4)2SO4만을 사용할 경우 3g/l첨가시 수율이 0.51로 가장높게 나타났다. 따라서 yeast extract의 첨가는 균체의 증식에는 영향을 주지만 다당류의 생산수율에는 거의 효과가 없는 것으로 판단되었다.

배양시 초기 pH를 2.0에서 9.0까지 변화시켜 본 결과(Fig. 2) 균체증식은 pH가 증가될수록 서서히 증가하였으나, 다당류 생산량은 pH 2.5에서 4.5사이의 산성에서 가장 높았으며 pH 5.0 이상 중성과 약알칼리성에서는 급격히 감소하였다. 또한 배양중 pH는 급격히 감소하여 모든 경우에 있어서 24시간이후 pH는 2.0이하로 일정하게 유지되었으며, 이것으로보아 본 균주는 내산성이 매우 강한 것으로 생각된다.

본 균주에 의한 다당류 생산의 최적온도를 검토한 결과(Fig. 3) 22℃에서 균체증식 및 다당류 생산량이 최대로 나타났으며, 30℃에서는 다당류가 전혀 생산되지않았다.

KH2PO4의 농도에대한 영향에서 균체의 증식은 인산염의 농도에 거의 무관하였으나, 다당류의 생산은 크게 영향을받아 1g/l첨가시 가장 높은 생산량을 나타냈으며, 첨가하지 않았을 경우와 2g/l이상의 농도에서는 거의 생산되지 않았다.(Fig. 4)

Table 1. Effect of carbon sources on the EPS production

carbon sources	dry cell weight (g/l)	EPS(g/l)	YP/X
glucose	9.15	2.87	0.31
fructose	9.31	2.28	0.24
sucrose	9.18	2.81	0.30
lactose	0.74	-	-
maltose	7.65	2.21	0.28
galactose	7.30	1.78	0.24
xylose	8.08	-	-
mannose	7.97	2.41	0.30
cellobiose	8.34	2.02	0.24
manitol	5.29	-	-
sorbitol	8.63	1.62	0.19

Table 2. Effect of nitrogen concentrations on the EPS production

yeast extract(g/l)	(NH4)2SO4(g/l)	dry cell weight (g/l)	EPS (g/l)	YP/X
0	0.5	6.06	-	-
	1.0	6.32	2.36	0.37
	2.0	6.19	2.98	0.48
	3.0	6.58	3.36	0.51
	5.0	6.71	3.00	0.44
1	0.0	6.17	-	-
	1.0	7.58	2.09	0.28
	2.0	7.55	3.59	0.48
	3.0	7.42	3.43	0.46
	5.0	7.88	3.33	0.42
2	0.0	8.83	-	-
	1.0	9.01	2.19	0.24
	2.0	8.76	3.32	0.38
	3.0	8.28	3.04	0.37
	5.0	7.80	3.23	0.41

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참 고 문 헌

1. Bernier, b. Canadian Journal of Microbiology. 4 195-204 (1958)

2. Brierly, C. L., D. P. Kelly, K. J. Seal and D. J. Best. Fackwell Scientific Pub.,       Oxford. 186-204 (1985)

3. Congregado, F., I. Estanol, M. J. Espuny, M. C. Fuste, M. A. Manresa, A. M.       Marques, J. Guinea and M. D. Simon-Pujol. Biotechnol. Letters. 7(12) 883-888       (1985)