제조용 정상 액체크로마토그래피에서 이동상 조성의 최적화

박영광, 장경곤, 노경호, 정성택

인하대학교, 화학공학과

Optimization of Mobile Phase Compositions

in Preparative Normal Phase Liquid Chromatography

Young Kwang Park, Kyung Kon Chang

Kyung Ho Row, Sung Taik Chung

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서론

제조용 크로마토그래피는 고순도 정제제품을 얻기 위해서 정밀화학 및 제약회사 등에서 계속적인 연구와 개발이 진행되고있다. 제조용 크로마토그래피는 분석 기기와는 여러 가지면 에서 다른 성질을 가지고 있다. 많은 원료 양에 의한 흡착평형식의 비선형성, 큰 용량의 pumping system, 원료주입에 관한 문제들이고 더욱 개선되어야 할 부분이다. 제조용 크로마토그래피에서 중요한 사항은 peak shape, 제조용 column의 크기, 충진물의 크기, 조업형태에 관한 것이다[1].

본 연구에서 다루고자 하는 물질은 taxol로서 주목나무에서 추출되는 taxane diterpene amide이다[2]. 이 자연 추출물은 백혈병의 치료제로 탁월한 성능을 가지고 있으며, 자궁암, 유방암, 후두암 및 불치성 말라리아 등에 대해서도 효과가 있음이 임상학적 실험으로 증명되었다. 주목나무 추출물에서의 분리하는 방법이 taxol을 얻는 방법으로 가장 많이 사용되고 있다.  이 밖에도 합성하는 방법은 taxol의 복잡한 화학적 구조 때문에 큰 성과를 거두지 못하고 있으며 주목나무 추출물 중 전구체를 이용한 semi-synthesis가 이루어지고 있다.

크로마토그래피를 이용한 taxol의 분리는 정상 및 역상의 analytical scale의 많은 연구 이후에 최근에는 preparative scale의 분리에 대한 실험 결과가 발표되고 있다. 이 중에서 주목나무에서 역상에서는 water중의 acetonitrile(30-60%)의 조건으로 얻어진 extract를 여과와 재결정 단계를 거쳐서 짧은 silica column을 사용하여 0.012-0.015%의 수율을 얻었고, 정상 상에서의 분리는 Zorbax SW-Taxane column을 이용하여 heptane:EtOH=50:50(vol.%)의 조성에서 5가지의 standard를 분리하였다.

인하대학교 고순도분리 연구실에서는 주목나무로부터의 taxol의 분리에 관한 실험이 진행중이며 analytical scale에서의 taxol을 분리하였고 이어서 preparative scale로의 단계를 위한 실험이 진행중이다. 정상(normal phase)과 역상(reverse phase) HPLC에 대해서 각기 분리조건을 확립하였다. 정상조업에서는 Novapak-silica column을 사용하여 이성분계 이동상 조성에서는 hexane:EtOH=96:4 (vol.%), 삼성분계에서는 hexane:1-propanol:MeOH=96:2:2(vol.%)이었다. 반면에  Curosil-PFP column을 사용한 역상조업에서는 water:acetonitrile=60:40(vol.%), water:MeOH =40:60(vol.%), water:acetonitrile:MeOH=56:39:5(vol.%)의 이동상의 조성에서 분리가 되었다[3,4]. 본 연구의 목적은 이전에 얻은 분리조건을 이용하여 제조용 규모에서 이동상의 조성을 최적화 하는 것이다. 정상조업에서 silica column을 사용하여hexane, methanol, IPA, 1-Propanol, ethanol을 이동상으로 사용하여 종류와 조성에 따라 많은 양의 taxol을 분리하기 위한 조건을 구하고자 한다.

실험

1. 추출과 농축

추출은 임목육종연구소에서 제공한 주목나무 powder(건량기준 10g)에   메탄올 1□로 하루 이상 침적하였다. 추출이 끝난 extracts 125□에 chloroform  100□와 water 100□를 혼합하여 30분간 교반하고 분별 깔때기로 2시간에서     14시간정도 침강시켰다. 이 공정을 두 번 반복하여 실시한 후 bottom layer(100□)를 채취하여 rotary evaporator (LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)에서 syrup이 될 때까지 농축한다. 이 syrup에 다시 메탄올을 가하여 5,000ppm 시료를 만든다.

2. 크로마토그래피분리

본 실험에 사용된 standard(10-deacetylbaccatin, 7-epi-10-deacetylb accatinⅢ, baccatinⅢ, 7-epi-10-deacetyltaxol, cephalomannine, 10-deacetyl-   taxol, taxol)는 NCI(the National Cancer Institute. Bethesda, MP, USA)에서 제공하였고, 추출한 시료를 injection volume 30□, flow rate 1□/min, UV-wavelength 228nm에서 hexane, 1-propanol, IPA, methanol, ethanol의 mobile phase의 조성을 실험변수로 하였다.

실험에 사용된 장치는 pump(Model 2326-26, TSP), U6K injector(2□ sample loop), 3000psi까지 측정 가능한 pressure gauge(Span instrumant Co.) 등으로 구성되어 있고, 시료 검출은 Absorbance Detector(M720, Young In Co.)를 사용하였으며, □-Bondapak column(3.9×300mm)에 10/40□의 silica packing을 충진하여 사용하였다.

3. 주목나무 추출물에서 taxol의 수율

주목나무 분말 3g에 메탄올 30□을 사용하여 taxol을 추출한다. 추출 액에 20□에 클로로포름 20□와 물 20□로 분배한 후 완전 증발시킨다. Syrup 0.073g에 메탄올 7.3□를 첨가하여 시료를 만든다. 시료 30□를 칼럼에서 분리한다. 크로마토그램에서 taxol의 peak 면적을 구하였고 100ppm 표준시료를 10□, 20□, 30□를 loading한 후 peak 면적을 측정하여 다음과 같은 linear regression 식을 얻었다.

taxol의 무게 [□] = 0.00102×(peak 면적) - 0.27118

이 식을 이용해서 추출액 30□에 포함된 taxol의 양이 1.5179□임을 알 수 있고, 주목나무 분말 3g에는 369.355□의 taxol이 포함되어있다. 전체 주목나무 분말에 포함된 taxol의 수율은 약 0.0123%이다.

injection amount	taxol amount	peak area
10 □	10 □	1374.877
20 □	20 □	2043.747
30 □	30 □	3285.507

Methanol 대신에 ethanol, chloroform대신에 dichloromethane을 사용하여 taxol을 추출하는 경우에는 전체 주목나무 분말에 포함된 taxol의 수율은 약 0.0042%이었다.

결과 및 고찰

Analytical-scale의 분리실험에서 Fig. 1은 Nova-Pak column에서 삼성분계 이동상에서 taxol, 10-deacetyltaxol, cephalomannine 각각 100ppm 용액을 혼합한 standard mixture에 대한 chromatogram이다. 사용된 이동상의 조성은 hexane과 1-propanol, EtOH을 96:2:2(vol.%)로 하여 일정용매 조성법(isocratic mode)에서 실험하였다. 이 조건에서는 3성분의 mixture에서 taxol을 분리하였다. 제조용 정상 column에서 solvent의 polarity를 변화시키면서 taxol을 분리도를 고찰하였다. Fig. 2는 silica column에서 이성분계 이동상에서 taxol, 10-deacetyltaxol, cephalomannine 각각 100ppm 용액을 혼합한 standard mixture에 대한 chromatogram이다. 사용된 이동상의 조성은 hexane과 EtOH을 92:8(vol.%)로 하여 일정용매 조성법(isocratic mode)에서 실험하였다. 3성분의 mixture에서 10-deacetyltaxol만이 분리되었다.  Fig. 3는 preparative silica column에서 삼성분계 이동상을 사용하는 경우 3성분의 mixture에 대한 chromatogram이다. 이동상의 조성은 hexane과 IPA, MeOH를 80:10:10(vol.%)로 하여 일정용매 조성법에서 실험하여 taxol을 분리하였다.

역상 HPLC에 의한 taxol분리는 문헌에 자주 등장하고 있지만 정상 HPLC에 대해서는 상대적으로 적다. 향후 taxol에 대한 분리공정을 수행하기 위한 전 단계로서 본 연구에서는 제조용 silica를 사용하여 이동상의 조성을 최적화하고 이 조건에서 최대 가능한 시료 양을 정량적으로 고찰하고자 한다.

참고문헌

1. Eli Grushka.: "Preparative-Scale Chromatography", Marcel Dekker INC,        New York(1989).

2. Wani, M.C.,  Taylor, H.L.,  Wall, M.E.,  Coggon, P. and  McPhail, A.T.:

J. Am. Chem. Soc., 93, 2325(1971).

3. 장경곤, 노경호, 정성택, 공업화학, 제출중(1996).

4. 정용안, 정성택, 노경호, 화학공학, 제출중(1997).

감사

본 연구는 교육부 생물화학공학 분야 연구과제로 수행 중인 project입니다. 연구가 원활하게 진행될 수 있게 standard를 제공해 주신 NCI와 주목나무 powder를 제공해 주신 임목육종연구소에 감사를 표합니다.