twitch에 의한 근섬유의 변화연구

김덕술, 송주영

창원대학교 공업화학과

A study on the change of the muscle fiber by the twitch

Duck Sool Kim, Ju Yeong Song

Department of Chemical Technology, Changwon National University

Sarim-dong Changwon, Kyungnam, 641-773 Korea

서론

일반적으로 근육의 수축을 담당하는 중요한 단백질은 actin과 myosin이다. 근육수축의 기본과정은 myosin에 의한 ATP의 가수분해로 얻은 에너지를 사용한 양 단백질의 상호작용에 이다1).  근육 중에는 actin과 myosin이  filament상에서 분자집합으로 되어있고2), 액상에서 규칙적으로 배열하고 있기 때문에 X선회절로 그 구조가 규명 되어왔다3-5). 지금까지의 X선 시분할 측정에 의하면, actin-myosin분자가 이완상태에서 구조변화로의 전이에는 myosin head가 가는 filament로 이동 및 myosin head를 일정하게 정리하는 시간이 포함되어 있다. 이 연구에는 연속 단수축법(twitch)을 이용하여, 이것의 시간을 0으로 두고 actin-myosin의 장력발생에 동반하는 소과정을 X선회절에 의해 추적하였다. 본 실험에서는 골격근에 연속단수축을 주는 방법을 사용하였고, 적도반사와 myosin으로부터 나오는 자오반사의 강도변화의 시분할(time slice)측정을 하였다. 그리고  myosin crossbridge의 구조변화를 연구하였다.

실험

시료와 검출기간의 거리는 측정하고자 하는 반사를 다른 반사와 분리하여 기록할 수 있도록 약 2.4m로 하였다. 방사선 X선은 강력하기 때문에, 이 방사선에 의한 손상을 최소화 하기 위하여 data수집 이외에는 시료에 X선이 닿지 않도록 시료 앞에 고속 shutter를 두었다. PSD에 의한 1차원 X선 회절상의 신호를 computer에 접속한 CAMAC(type 3588, LecRoy Research System S.A., Switzerland) memory에 시간의 함수로서 저장하였다.  Memory는 256 channel, 128 prime으로 분할하였다. 측정 시간 분해능은 5ms로 행하였다.

장력 발생과정을 추적할 때, 그 과정을 비교하고 싶은 시간 분해능에 의존하고 몇 개의 시간적 구간(time slice)으로 나누어서, 각 시간상으로 1D-PSD에 검사한 data를 기록한다. 시간간격이 짧고, 1회 측정으로 기록하기에는 부족하기 때문에 측정을 반복한 data를 축적한다. 작성한 data file의 전시간 prime을 가산해서 구한 강도 profile에 대하여 극소치를 연결한 back-ground를 결정한 후에, 강도 profile을 각시간 prime의 공통 back-ground위의 peak의 적분강도를 계산하여 시간의 함수로 구하였다. 장력 data도 시간의 함수로서 동시에 기록하였기 때문에 양자의 data를 측정시간의 함수로서 최종적으로 나타내었다.

식용개구리(Rana catesbeiana) 의 봉공근(sartorius) 또는 반건양근(semetendinosus)의 살아있는 근육을 시료로 이용하였다. 근육의 크기는 길이가 4-5cm으로 두께는 약 1mm정도이다. 봉공근의 경우 혈관과 신경이 보이는 내측을 전극에 접촉시켰다. 근절의 길이는 He-Ne Laser의 광회절법으로 가는 filament와 굵은 filament의 full overlap의 길이(2.2-2.4um)로 조정하였다. 냉각한 개구리 ringer용액을 시료 cell중에 순환시켜 온도를 제어하였다.개구리 ringer용액의 조성과 조건은 115mM NaCl, 2.5mM KCl, 1.8mM CaCl2, NaHCO3, pH7.2이다.

결과 및 고찰

전기자극에 의한 개구리 골격근 이완상태의 회절상은 다음과 같다. X선 회절상은 앞서 말한 것과 같이 굵은 filament와 가는 filament의 나선구조에 의한 2개의 층선반사로 구성된다. 2개의 층선반사는 양 filament의 구조주기가 다름에 따라 일반적으로 분리된 형태로 나타난다.

Fig 1. X-ray diffraction pattern by twitch. The layer lines from thethick filaments are labelled 143 and 215 and those from the thick filaments are labelled 10, z, 11, 20, 21, 30.

Fig.1는 노출시간이 짧은 개구리 골격근의 X선 회절상을 표시하였다. 근육의 장축과 수직한 면, 즉 적도면 위에 나타나는 굵은 filament와 가는 filament의 6방배열에 의한 (100)면과 (110)면으로 부터의 반사와, 적도축에 수직한 중앙축, 즉 자오선 위에 나타난 굵은 filament의 crossbridge의 주기 구조로부터의 143[eqn: ANGSTROM] 과 215[eqn: ANGSTROM]자오반사의 강도변화를 비교하였다. 이것의 반사를 선택한 이유는 강도가 가장 강하게 나타나는 반사이기 때문에, 이것의 강도변화가  crossbridge의 움직임과 구조변화를 직접적으로 반영하기 때문이다6). 적도반사는 근육의 구조를 장축에 따라서 적도면에 투영한 구조를 반영하고, 자오반사는 근 선유축에 수직으로 투영한 근육의 구조를 반영한다. 즉, 양 filament에서 나오는 I10, I11, Iz, I20, I21, I30중에서 I10과 I11을 측정하였다.

앞에서 논하였던 것처럼 근육이 연속적으로 수축했을 때, 일단 발생한 변화는 처음으로 돌아가는 것이 아니고, 다음의 수축으로 이동하는 것이다7). 따라서, 단순한 단수축과 연속 단수축에서는 crossbridge의 운동과 구조변화를 검출하였다.

Fig 2. Time courses of change in equatorial intensities and tension. On contraction I10 decreases and  I11 increases in an opposite way. The figure is shown so that deviation of the intensites from their resting values becomes clear. Each data point represents a mean value of 6 different muscle.

Fig. 2.에서 연속단수축에 의한 I10의 반응은 확실하지는 않았지만, I11은 5회의 단수축에 대하여 5개의 peak가 명확히 관측되었다. I11은 각각의 자극으로 peak에 도달한 후 감소하였지만 처음으로는 돌아가지 않았다. I10은 최초의 자극으로 감소가 시작되었고, 그 후 낮은 값은 보존되었다. 이것은 최초의 자극으로 가는filament쪽으로 일단 한번 이동한 crossbridge가 그 후의 연속수축 중 가는filament의 부근에 머물러 있는 상태에서 다음의 자극으로 한번에 갑자기 힘이 발생하는 것을 암시하고 있다. 이 그림에서 명확히 증명되어진 것은 각각의 자극개시로부터 I11의 여러 가지의 peak에 도달하는 시간 Ii가 장력의 경우와 같이 연속자극에 의해 감소하고 있다는 것을 시사한다.

다음은 굵은filament에서 발생하는 143Å와 215Å자오반사의 강도변화를 비교하였다.  이 2개의 반사는 myosin filament의 기본주기(430Å)의 3차와 2차반사에 해당한다.

Fig. 3. Time courses of changes in the 143Å and 215Å intensites and tension when the muscles were simulated by 5 succesive pluses at an intervel of 80 ms at 13℃. The first stimulation was given at t=0, and the times, when the muscle was stimulated, were shown by the vertical lines.

Fig. 3.에서 이 2개의 반사의 강도변화를 장력변화와 함께 나타내었다. 143[eqn: ANGSTROM]자오반사는 굵은filament에서 튀어나온 2개의 head로부터 되는 myosin-crossbridge의 규칙배열로부터 오는 반사이다8-9). 적도의 I11반사의 변화와 같이 I143은 연속자극으로 증가하는 3회이후의 증가는 포화하는 경향을 나타낸다. 자극과 자극의 사이에는 일단 감소하지만 이완상태 leval까지 내려가지는 않았다. 자극개시후 I143의 peak에 도달하는 시간(Ii)은 62.5ms(I1), 45.0ms(I2), 41.3ms(I3), 38.8ms(I4), 그리고 53.0ms(I5)는 감소하였다.  Ii의 감소가 관측되지 않은 150ms의 자극간격에는 I215는 자극과 자극사이에 현저한 회복이 관측되었고, 가는filament근방에 있는 myosin-crossbridge가 자극과 자극사이에의 이완위치에 돌아오는 것을 시사하고 있다.

따라서, 자극간격 80ms, 온도 13℃의 실험 조건하에서 최초의 자극으로 한번 가는filament의 근방에 이동한 myosin-crossbridge는 그 후의 연속 단수축중에는 이완위치에 돌아가지 않고, 가는filament 근방에 머물고 있다는 것을 강력히 시사하고 있다.

결론

근육 수축중에 X선 구조분석에 의해 관찰되어진 두드러진 변화는 근육수축을 하는 가운데 myosin head의 움직임과 수축분자의 구조적 변화가 관찰되었다. 시분할은 자극후 장력peak를 필요로 하게 되고, 장력peak의 크기는 단수축 자극에 의존하였다. I10, I11, 134Å과 215Å의 강도는 5ms 분해능으로 측정하고, 모두 등척성 장력으로 기록된다. 강도I11와 143Å의 peak는 자극 Ii의 시작 후에 변하고, Ti 경우 단수축의 거리가 단축되었다. 한편, 장력I10와 215Å의 peak는 최초의 단수축이 감소하기 시작하였고, 수축하는 동안에는 장력이 회복되지 않고 낮은 값으로 유지되었다. 연속적인 단수축으로 자극할 경우,  일반적인 예상과는 달리 최초의 자극후 근육의 myosin head가  처음 이완상태로는 되돌아가지 않는다는 것을 알 수 있었다.

참고문헌

1. A.  F.   Huxley and  M. Simmons(1971), Nature, 233, 533.

2. H. E. Huxley, A. R. Farqi, M. Brown(1967), J. Mol. Biol., 30, 384.

3. H. E. Huxley, R. M. Simmons, A. R. Farqi, M. Kress(1982), J. Bordas & Mol. Biol., 169, 469.

4. H. E. Huxley, A. R. Farqi, M. Kress, J. Bordas and M. H. J. Koch(1983), J. Mol. Biol., 158, 637.

5. Y. Amemiya, K. Wakabayashi, T. Hamanaka,  T. Wakabayashi,  T. Matsushta & H. Hashizume(1983), Nucl. Instrum. Methods, 208, 471.

6. K. Wakabayashi, Y. Amemiya(1991),  Handbook on  Synchrotron  Radiation., Vol. 4, North Holland, Amsterdam, pp. 597-678.

7. K. Wakabayashi, H. Tanaka, T. Kobayashi, T. Hamanaka, S. Nishizawa, H. Sugi and T. Mitsui(1986), Biophys. J., 49, 581.

8. I. Matsubara & N. Yagi(1985), J. Physiol., 361, 151.

9. J. J. Harford & J. M. Squire(1982), Biophys. J., 63, 387.