Phaffia rhodozyma로부터 astaxanthin 추출용

초임계유체와 유기용매 공정의 비교분석

안지연, 이은규, *이상윤, *임교빈

한양대학교 화학공학과, *수원대학교 화학공학과

Process Comparison between Supercritical Fluid and Organic Solvent Extraction of Astaxanthin from Phaffia rhodozyma

Ji-Youn Ahn, Eun-Kyu Lee, *Sang-Yun Lee, *Gio-Bin Lim

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

*Department of Chemical Engineering, The University of Suwon

서론

Astaxanthin은 카로테노이드류의 색소로서 연어, 도미, 게, 새우 등의 적색 성분의 대부분을 이루는 물질(1)로서 대부분 어류양식의 사료로 사용되어 북유럽을 포함한 선진국에서는 매우 큰 시장을 형성하고 있다.  또한 면역기능, 항산화력(2) 등의 기능성이 알려지면서 식품첨가제 및 의약품소재로서의 활용이 연구되어지고 있다.

새우, 가재, 미생물 등을 주원료로 한 astaxanthin의 추출은 일반적으로 유기용매를 사용하여 추출하였으나 이 방법은 추출후에 불순물의 분리와 지질제거가 필요하며, 또한 식품첨가제나 의약품소재로 사용하기 위해서는 잔류용매가 완전히 제거되어야 하는 등 추출공정이 복잡하다.  반면 초임계유체를 통한 추출은 공정이 간단하며 초임계유체로 사용하는 CO2의 경우 인체에 무해하므로 새로운 추출방법으로 연구되어지고 있다.

본 연구에서는 발효를 통해 얻은 적색효모 (Phaffia rhodozyma)로부터 astaxanthin의 추출을 위해 유기용매와 초임계유체 추출을 수행하고 각각의 공정에서의 추출물의 성분 및 순도를 비교분석하였다.

재료 및 방법

본 실험에서 사용된 건조된 Phaffia rhodozyma는 (주)제일화학에서 제공되었으며 astaxanthin 표준품 (제품번호: A9335)은 Sigma사에서 구입하였다.  세포파쇄는 homogenizer와 초음파분쇄기를 사용하였다.  유기용매 추출방법에서는 세포파쇄를 위해 Phaffia rhodozyma 건조세포 200 mg을 아세톤 50 ml에 넣어  homogenizer 또는 초음파분쇄기로 저온을 유지하여 파쇄하였다.  초임계유체 추출법에서는 세포파쇄로 세포 1 g을 증류수 10 ml에 넣어 homogenizer로 2시간 파쇄 후 완전건조한 뒤 막자사발로 분쇄하였다.  초임계유체 추출공정은 35-40℃, 압력 300 kg/cm2 조건하에서(3) 12시간 동안 실행한 후 분석을 위해 색소추출물을 아세톤 50 ml에 용해시켰다.  추출장치는 Fig. 1에 도시되어 있다.  사용된 초임계유체는 CO2이고 보조용매는 사용하지 않았다.  색소추출 후 공추출되는 불순지방질 제거를 위해서 NaCl을 이용한 비누화, 초저온 냉동 (-70℃)을 통한 응결, 실리카겔 칼럼을 이용한 분획 등을 사용하였다.  냉동법은 -70℃ 초저온냉도고에 추출물을 2시간 보관한 후 액층만 취하였다.  비누화법은 NaCl 1M 용액을 추출물에 첨가하였다.  크로마토그래피를 이용한 방법으로는 실리카겔 칼럼에 추출물을 통과시켜 불순물을 흡착시켰는데 두가지 방법을 사용하였다.  첫번째 방법은 hexane 100%를 사용하였고 두번째 방법은 석유에테르에 아세톤을 5∼15%로 gradient를 주어 추출물을 흡착시켰다.

추출물의 분석은 RP-HPLC (C8 칼럼)과  TLC (Merck silica gel 60 F254)를 이용하였다.  색소추출물중 총 카로테노이드는

[eqn: 총카로테노이드 (□/g yeast) ~= ~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~# { rm Absorbance~ at~ lambda _ max rm `TIMES ` 100 `TIMES `volume~ of ~acetone~ extract }over {21` TIMES` RM dry ~weight~ yeast }]

로 정량하였다(4).  색소추출물중의 단백질은 Lowry법(5)을 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였고 지방은 속슬렛법으로 정량하였다.  색소추출물중 astaxanthin의 정량분석은 메탄올 50%로 HPLC로 실시하였고 TLC는 석유에테르 85%, 아세톤 15%로 분석하였다(6).

결과 및 고찰

Phaffia rhodozyma에서 색소의 분리는 세포파쇄로부터 추출이 매우 중요한 부분을 차지한다.  세포파쇄 방법으로 homogenizer와 초음파분쇄기를 사용하여 비교하여 보았다 (Fig. 2).  Homogenizer와 초음파분쇄기로 세포파쇄를 한 후 비교하였더니 homogenizer가 효율이 약 3배 높았다.  그 이유는 Phaffia rhodozyma가 □-glucan 구조를 포함한 □-glucan 구조를 가지고 있기 때문에 외각이 단단하기 때문인 것으로 사료된다.  파쇄시간에 따른 비교를 보면 6시간 정도가 적당한 것으로 나타났다.  유기용매별 세포파쇄정도는 Hata에 따르면 아세톤이 85.8%로 가장 효율이 좋은것으로 알려져 있어(7), 이후 유기용매 추출은 아세톤에서 6시간동안 homogenizer로 실시하였다.

아세톤으로 추출후 원심분리한 뒤 상층액만을 회수하였다.  초임계 추출을 위해 세포 1 g을 넣어 12시간 추출한 결과 잔류된 세포질량은 0.87 g이었다.  따라서 추출질량은 0.17 g으로 이는 세포내에 포함된 총 지방의 질량과 거의 일치한 것으로서 초임계 추출시 색소를 포함한 모든 지방류가 유출되는 것으로 추정할 수 있었다.

순수한 astaxanthin의 정량을 위해 RP C8 칼럼을 사용하고 메탄올 50%로 용출시킨 결과 약 5분에서 astaxanthin이 유출되었다.  아세톤 추출과 초임계유체 추출로 얻은 색소추출물질은 HPLC로 분석한 결과 초임계유체 추출물이 유기용매 추출물보다 비교적 불순물이 적었다 (Fig. 5).  뿐만아니라  초임계유체 추출공정은 유기용매 추출공정에 비하여 공정이 간단하고, 초임계유체로 CO2를 사용하므로 생체에 무해하며, 용매를 큰 추가투자없이 재사용할 수 있으므로 초임계유체 추출공정이 식품소재용 추출공정에 더 적합하다고 판단된다.

정제공정에서는 비누화법, 냉동법, 실리카겔 칼럼법으로 불순지방의 양을 감소시키고 색소의 순도를 높이고자 하였다.  각 정제공정 후 TLC를 통해 astaxanthin과 기타 지방물을 분석하였다 (Fig. 3).  비누화방법을 수행후 불순물이 줄어 들었고, 냉동법을 사용했을 때 정제효율이 가장 좋았으나 산업화 공정을 위해서는 부적당한 것으로 나타났다.  실리카겔 칼럼 경우 석유에테르와 아세톤을 5-15%로 gradient를 주었더니 맨 윗 부분에서 astaxanthin이 선별적으로 흡착되었으며 이에 대한 정제수율 및 효율은 현재 연구수행 중이다 (Fig. 4).

결론 및 향후 연구방향

적색효모 세포파쇄방법에서 homogenizer가 초음파분쇄기보다 우수함을 알 수 있었고, 최적의 파쇄시간은 6시간정도로 나타났다.  또한 1차 추출공정으로서 아세톤 추출과 초임계유체 추출을 비교해 본 결과 초임계유체 추출공정이 보다 효율적으로 비교적 고순도의 astaxanthin을 추출함을 볼 수 있었다.  공추출된 불순 지방물을 분리하기 위한 정제방법으로는 냉동응결법이 우수하였으나 대규모 공정으로는 부적합할 것 같아 비누화와 실리카겔 칼럼법을 이용한 결과 astaxanthin만을 분획정제할 수 있었다.  앞으로 이러한 추출정제방법을 통하여 정제된 astaxanthin을 식품첨가물 및 의약용소재로 사용하기 위하여 항산화력과 같은 생물학적 기능성을 측정할 예정이다.

참고문헌

1. R. D. G. Cooper, J. B. Davis, A. P. Leftwick, C. Price, and B. C. L.

Weedon,  □Carotenoids and Related Compounds. Part XXXII. Synthesis of

Astaxanthin, Phoenicoxanthin, Hydroxyechinenone, and the Corresponding

Diosphenols," 2195-2204 (1975).

2. J. Tera, "Antioxidant Activity of □-Carotene-Related Carotenoids in

Solution," Lipids, 24, 7, 659-661 (1989).

3. □□□□□□□色素□抽出分離方法, JP 04057853 (1990).

4. R. P. K. Sangha, T. Patel and A. M. Martin, "Growth and Pigmentation in

Rhodotorula rubra and Phaffia rhodozyma," J. Basic Microbiol., 35, 1,

53-56 (1995).

5. E. A Johnson, T. G. Villa and M. J. Lewis, "Phaffia rhodozyma as

Astaxanthin Source in Salmonid Diets," Aquaculture, 20, 123-134 (1980).

6. .E. A. Johnson, D. E. Conklin, and M. J. Lewis, "The Yeast Phaffia

rhodozyma as a Dietary Pigment Source for Salmonids and Crustaceans,"

J. Fish. Res. Board Can, 34, 2417-2421 (1997).

7. K. Hata, "微生物由來□ □□□□□□□□□□□ 赤色色素□特性," 月刊□-□    □□□□, 11, 63-68 (1994).

Fig. 1. Schmatic Digram of Supercritical	Fig. 2. Astaxanthin Release Profile during

Fluid Extraction Process	Cell Disruption

Fig. 3. 불순지방물 제거후 TLC를 이용한 분석	Fig. 4. Silica column fraction과 유기용매

1. 98% astaxanthin(Sigma)	및 초임계유체 추출물들의 TLC분석

2. organic solvent extraction	1. 최상층 흡착부

3. organic solvent extraction after	2. 상층 흡착부

addition NaCl	3. 하층 흡착부

4. organic solvent extraction after	4. 최하층 흡착부

NaCl and petrolum ether addition	5. organic solvent extraction

5. 헥산을 용매로 silicagel column에 흡착	6. supercritical fluid extraction

6. freeze-thaw method

Fig. 5. HPLC Profiles of Astaxanthin Extracts

(a) solvent extraction with acetone     (b) after silica treatment of acetone-extracted

(c) supercritical fluid extraction            astaxanthin