미생물 단백질과 다당류가 생물막 형성에 미치는 영향

박영식, 윤종원*, 송승구

부산대학교 화학공학과, 대구대학교 생물공학과*,

Effect of Microorganism  Protein and Polysaccharide on the Biofilm

Formation

Young-Seek Park, Jong-Won Yun, Seung-Koo Song

Dept. of Chem. Eng. Pusan National University, Dept. of Biotechnology, Taegu University*,

서론

생물막 공정에서 미생물의 초기 부착은 반응기의 빠른 start-up과 안정적인 운전을 위해 중요한 요소이다. 미생물-미생물, 미생물-담체 사이의 정전기 상호작용(electrostatic interaction)과 소수성 상호작용(hydrophobicity interaction) 및 미생물의 표면 특징(feature), 특히 그 중에서도 세포외 고분자 물질(extracellular polymer substances : EPS), 편모(flagella)나 섬모(fimbriae 또는 pili)가 미생물 부착에 영향을 미친다고 보고되고 있다[1, 2]. 다당류(polysaccharides)를 함유하고 있는 세포외 고분자 물질은 미생물 부착과 생물막 형성에 영향을 미친다고 알려져 있으나 미생물 부착에 대한 세포외 고분자 물질의 역할에 대해서는 다양하게 보고되고 있으며, 편모나 섬모와 같은 세포 부속기관의 역할에 대해서도 잘 알려져 있지 않다[3, 4]. 본 연구는 세포외 고분자 물질과 편모 등의 세포 부속기관이 활성슬러지 부착에 미치는 영향을 고찰하기 위해 세포외 고분자 물질의 주요 성분이라고 알려진 다당류와 편모 등의 주요성분이라고 알려진 세포 표면 단백질[5, 6]을 미생물 표면으로부터 제거하였을 때의 미생물 부착능을 고찰하였다.

실험

-세포외 다당류와 단백질 성분 제거

실험 미생물로는 활성슬러지를 사용하였으며, 세포외 고분자 물질의 주성분이라고 알려진 다당류 성분을 다당류 산화제인 sodium-metaperiodate를 10mM PBS(pH 7.2)에서 농도를 5mM로 조절하고 활성슬러지 90mg/L를 투입하여 30℃에서 3시간동안 다당류를 산화시키고 순수 증류수로 3번 세척하고 다당류가 제거된 활성슬러지로 부착 실험하였다[7]. 단백질 분해효소인 pronase E(sigma사 protease, 4.5 activity/mg)를 pH 7.2의 PBS에서 0.05%(w/v)로 만든 후 활성슬러지에 첨가하고 pronase의 최적 활성을 유지하기 위해 40℃에서 세포 단백질 성분을 제거하고 순수 증류수로 3번 세척하고 농도를 90mg/L로 맞춘 다음 30℃에서 3시간동안 부착 실험하였다.

- 부착실험

2.5cm x 2.5cm 크기의 아크릴 판을 페트리 접시에 접착시키고 다당류와 단백질 성분이 제거된 활성슬러지 90mg/L로 농도를 조절하고, 30℃로 맞춘 shaking water bath에서 3시간 동안 부착 실험을 수행하였다. 3시간 후 아크릴 판을 분리시키고20mL의 증류수가 들어 있는 시험관에 넣어 4000rpm에서 10분간 원심분리시키고, Vortex mixer(Vision KMC-1300V)에서 5분간 미생물 군집을 파쇄하고 시료 1mL를 8.5% 생리식염수 9mL에 넣고 10배씩 적절하게 희석하여 페트리 접시에 1mL를 넣고 plate counter agar(Difco)를 붇고 agar가 굳어지면 30℃로 고정한 배양기에서 24시간 동안 배양 후 colony counter(Fisher Accu-lite Model 133-8002)로 배양된 미생물 군집수(CFU : colony forming unit)를 계수한다.

-TEM 관찰

조건에 맞추어 처리된 활성슬러지를 순수 증류수로 3회 세척한 후, 2.5% glutaldehyde로 실온에서 2시간 전 고정시킨 후 1% osmium tetroxide로 2시간 후 고정시킨다. 이때 사용한 모든 시약의 희석은 0.1M 인산완충용액(pH 7.2)으로 하였으며, 동일한 완충용액으로 세척하였다. 고정된 미생물을 연속적으로 60, 70, 80, 90 및 100%의 ethanol로 탈수하고 propylene oxide로 조직을 치환한 다음, Epon 812에 포매(embedding)하여 60℃ 건조기에서 24시간 중합시킨 후, ultramicrotome(ULTRACUT, Reicher-Jung)을 이용하여 0.35□크기로 semi-thin section하여 toluidine blue로 염색한 후 광학현미경으로 관찰할 부위를 결정한다. 관찰할 부분을 ultrathin section(90nm)하고 200 meth copper grid에 section을 부착하여 투과전자현미경(JEM 1200EX-Ⅱ, Joel, Japan)에서 관찰하였다.

결과 및 고찰

-세포외 다당류의 영향

Fig. 1은 다당류 산화제인 sodium metaperiodate로 세포외 고분자 물질을 구성하고 있는 주요 성분인 다당류를 제거하고 부착에 미치는 영향을 고찰하였다. 다당류 산화제로 처리되지 않았을 때는 34.0 x 107CFU/cm2의 활성슬러지가 아크릴 판에 부착되었으나 sodium metaperiodate로 처리되었을 때는 20.2 x 107CFU/cm2이 부착되어 41% 감소되었다. 활성슬러지에서 다당류 성분을 제거하였을 때 부착이 감소하는 것으로 보아 다당류를 함유하고 있는 세포외 고분자 물질이 미생물 초기 부착에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다.

- 세포 단백질 성분의 영향

Fig. 2에 활성슬러지를 단백질 분해효소인 pronase로 처리하였을 때 부착된 미생물 군집수를 측정한 결과를 나타내었다. Pronase가 처리되지 않은 활성슬러지는 30.1 x 107CFU/cm2이 부착되었으나 pronase로 처리한 뒤 16.4 x 107CFU/cm2가 부착되어 45.3% 감소되어 편모나 섬모와 같은 세포 표면 부속기관이 미생물 부착에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. Pronase로 처리되었을 때 미생물의 소수성을 나타내는 접촉각은 760에서 640로 감소되었는데 소수성이라고 알려진 표면 성분인 단백질 성분이 제거되었기 때문에 미생물의 소수성이 감소한다고 사료되었다.  세포 표면의 단백질과 양쪽성 분자가 여러 가지 미생물의 상대적인 표면소수성에 기여한다는 Rosenberg와 Kjelleberg[8]의 연구 결과와 세포 표면 단백질 증가와 표면 소수성 증가는 부착 세포 수 증가와 관계된다고 보고한 Dufr□ne과 Rouxhet[9]의 보고와 비교해 볼 때에도 활성슬러지 표면 단백질은 부착능과 관계되며 소수성과도 관계된다는 것을 알 수 있었다.

- TEM 관찰

Fig. 3은 세포 표면의 단백질 성분이 활성슬러지 부착에 미치는 영향을 고찰하기 위하여 원래의 활성슬러지(a)와 단백질 분해효소인 pronase로 처리한 활성슬러지(b)를 TEM으로 25000배 확대하여 관찰한 것으로 pronase로 처리되지 않았을 때에는 세포벽이 선명하게 관찰되지 않고 세포벽 주위로 섬유상 물질이 관찰되지만 pronase로 활성슬러지를 처리하였을 때 (b)에서 보이는 것과 같은 세포벽 주위가 선명하게 보이고 섬유상 물질이 전혀 관찰되지 않아 pronase가 세포 부속기관인 섬모나 편모 등을 제거하는 것을 알 수 있었으며, 미생물 부착과 관련하여 볼 때 활성슬러지 표면의 세포 부속기관이 부착에 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.

결론

세포 표면 성분 중에서 세포외 고분자 물질을 구성하고 있는 물질의 주요 성분인 다당류와 표면 부속기관을 이루고 있는 주요 성분인 단백질을 제거하여 담체인 아크릴 판에 부착시켰을 때 부착되는 미생물 군집수가 감소하여 세포 표면 성분이 미생물 부착에 많은 영향을 주는 것을 알 수 있었다. Pronase로 단백질 성분을 제거하였을 때 세포 표면을 TEM으로 관찰한 결과 세포벽이 선명하게 관찰되었고 섬유상 물질이 제거된 것을 확인할 수 있었다.

참고문헌

1. Marshall, K.C.,  Stout, R., and Mitchell, T., "Mechanism to the Initial Events in      the Sorption of Marine Bacteria to  Surfaces", J. Gen. Microbiol., 68,               337-348(1971).

2. Stenstr□m, T.A., and Kjelleberg, S.,"Fimbriae mediated Nonspecific Adhesion of       Salmonella typhimurium to Mineral Particles", Archives of Microbiology, 143,        6-10(1985).

3. Flemming, H.C., "Sorption Sites in Biofilms", Wat. Sci. Tech., 32(8), 27-33          (1995).

4. Nielsen, P.H., and Harremoes, P., "Biofilm Structure, Growth and Dynamics- Need     for New Concepts", IAWQ. Specialist groups on biofilm systems, Newsletter, 2,      Nov., 2-4(1995).

5. Corpe, W.A., "Microbial Surface components involved in Adsorption of              Microorganisms onto Surfaces", in adsorption of Microorganisms to Surfaces, G.      Bitton, and K.C., Marshall, (Eds.), John Wiley and Sons, New York, (1980).

6. 김병홍 등, 미생물의 생물학, 범한서적, 6판(1992).

7. Ratih, D, "Studies on Biofilm Formation by Escherichia Coli  O157:H7", Ph. D.      thesis, Wisconsin-Madison Univ., U.S.A., (1995).

8. Kjelleberg, S., and Hermansson, M., "Starvation-Induced Effects on Bacterial          Surface characteristics", Appl. and Environ. Microbiol., 48, 497-503(1984).

9. Dufr□ne, Y.F., and Rouxhet, P.G., "Surface Composition, Surface Properties, and      Adhesiveness of Azospirillum brasilense- Variation during Growth", Can. J.          Microbiol, 42, 548-556(1996).

Fig.1. Effect of polysaccharide oxi-     Fig.2. Effect of pronase treatment on

dizing agent on the microorganism       the microorganism attachment.

attachment.

(a)                                      (b)

Fig.3. TEM photographs of activated sludge before(a) and after(b) treatment with

pronase.