단백질의 알칼리 가수분해조건과  아미노산-구리(Ⅱ)착물의

살균성에 대한 연구

최상원, 이상태, 정관용, 오남희, 방정환*, 김정우**

여수대학교 화학공학과, 서남대학교 화학과*, 서남대학교 생물학과**

Condition of protein hydrolysis by alkali and  disinfectant properties of  amino acid-copper(Ⅱ) complex

Sang Won Choi, Sang Tae Lee,  Kwan Yong Jeong, Nam Hee Oh, Jeong Whan Bang*, Jung Woo Kim**

Dept. of Chemical Engineering, Yosu Univ., Yosu, 550-749, Korea,

Dept. of Chemistry, Seo Nam Univ., Nam Won 590-170, Korea*

Dept. of Biology, Seo Nam Univ., Nam Won 590-170, Korea**

1. 서론

지금 까지 아미노산을 얻기 위하여 알려진 가장 일반적인 단백질의 가수분해법은 1963년 S. Moore와 W. H. Stein에 의한 산가수 분해법(6N HCl, 110℃ for 16∼72h) 이다. 그러나 산가수분해를 하면 일차적으로 트리프토판이 깨어지고 시스틴이 산화되는 약점을 가진다. 이를 막기위해 1972년 T.E. Hugli와 S. Moore는 알칼리 가수분해(4.2N NaOH, 110℃ for 22h)를 실시했다. 또 다른 방법으로는 protease를 이용한 가수분해로 1984년 Chervan은 최소의 Proteolytic enzyme으로 단백질 가수분해를 발표했다.(1)

한편, 이렇게 하여 얻어진 아미노산을 이용한 비료, 항균제 또는 기타의 화합물합성에 대한 여러 연구가 있다. 특히 여러 가지 아미노산과 금속착물 합성에 대한 여러보고가 있다. 그중 구리(Ⅱ)금속과의 착물연구는 1996년 Michael은 산영역에서 PH적정 동안 구리(Ⅱ)와 Glycine과의 착물형성을 Visible spectra을 이용하여 연구(2)하였고, Labanowska는 Aniline과 구리(Ⅱ) 착물의 전기적인 상자기성에 대하여 연구하였다.(3) 또한 여러 아미노산과 또다른 aromatic diamine을 ligand로 하여 구리(Ⅱ)와 착물을 형성하고 이를 생물학적으로 응용하였다.(4) 최근에는 Yamashita등은  N-(long chain acyl) basic amino acid와 금속화합물을 강한 알칼리 수용액에서 혼합함으로써 항균성을 지닌 염화합물을 제조하여 항균성의 계면활성제로 이용한다고 보고하였다.(5) 또한 혼합된 아미노산과 구리착물을 합성하고 이를 항암제로서 이용하는 연구가 최근에 활발히 진행되고 있다.(6)

본 연구에서는 알칼리 가수분해에 의해 단백질 함유물질로부터 아미노산의 최적 분해조건을 찾고 이로부터 아미노산 구리착물을 합성하여 이물질의 살균력을 여러 균주을 통해 확인하였다.

2. 실험

2.1 시약

Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate(CuSO4·5H2O from Tedia company), ammonia(NH3 from Junsei Chemical. Co), sodium hydroxide(NaOH from 德山藥品)는 별다른 정제없이 사용하였고, 양쪽성 계면활성제를 합성하기 위한 재료로는 단백질이 다량 함유되어 있는 도축 폐기물을 가수분해하여 사용하였다.

2.2 단백질의 가수분해

양쪽성 계면활성제는 도축폐기물 100g을 건조후 수분량을 측정하고 이것의 조단백질양은 Kjeldahl정량법(7)으로 질소정량하여 결정하였다. 도축폐기물 100g을 500ml 반응기에 넣고 50% NaOH을 제조한 후에 이것을 농도별로 투여한 후 110℃까지 온도를 서서히 올린 다음 110℃로 22시간동안 condenser를 설치하고 환류 시키면서 단백질을 가수분해하여 아미노산를 얻었다. 가수분해된 아미노산은 상온에서 방치후 식으면 filtering하여 여액을 황산을 이용하여 중화후 이것을 다시 냉각하여 Na2SO4를 제거한후 이를 이용하였다.

[eqn: NH_2 -CHR-CO-(NH-CHR-CO)_n-2 -NH-CHR-COOH + nNaOH~ #-> ~nNH_2 -CHR-COONa +nH_2 O]

Scheme 1. Preparation route to Zwitterionic surfactant.

2.3  살균제 합성

아미노산 구리(Ⅱ)금속착물은 최대몰비 조건으로 상온 상압하에서 이루어 졌다. 가수분해된 아미노산을 50g을 취하여 500ml 반응기에 취하고  8.24g의 황산구리 5수화물을 물 50ml에 녹여 놓은 것을 반응기에 Mechanical stirrer로 저으면서 서서히 넣고 그리고 여기에 50% NaOH를 2.64ml를 주입한다. 주입되는 동안  Bubble의한 유출에 유의 하면서 3시간 정도 격렬하게 교반하여 반응을 시킨다. 반응이 끝나면 이것을 상온까지 식힌후 filtering한다.

2.4 분석

2.4.1. 아미노산 함량 분석

가수 분해시 첨가된 50% NaOH양에 따른 아미노산는 고성능 액체 크로마토 그래피(High performance liquidchromatography-fluorometric analysis system)로 분해정도와 정량화 하였다. 이때, 3.9×300nm, 4□의 column(ACCQ-tag, waters)을 사용하였고, Detector는 Waters 996 Photodiode array detector(PDA)를 사용하여 검출하였다

2.4.2. 살균효과 시험

살균효과를 보기위해 시험균으로 Escherichia coli, Salmonella typhi, Bacillus spp, Staphylococcus aureus, Pseudomonas anguilliseptica, Edwardsilla tarda를 사용하였으며, 이때 배지는 NA배지(Beef-Extract, Peptone, Agar)에서 36℃ 17시간배양하였다. 살균시험시 Buffer용액으로는 Tris buffer를 사용하였고 균접종액은 106마리/ml를 대상으로 합성된 시약을 500배, 1000배, 2000배를 희석하여 1시간, 3시간, 5시간, 24시간 시간의 경과에 따라 실시하였다. 배양온도는 37℃(Pseudomonas anguilliseptica는 30℃)를 유지하여 실시하였다.

3. 결과 및 토론

3.1 단백질 함량 결정

젖은 축산폐기물내의 단백질 함량을 보면 아래와 같고 이에 따른 50% NaOH량은 전체무게에 대해 15%∼16%에 이른다.

수분량	질소량	단백질량	질소mol	NaOH(g/kg)
75%	2.7∼2.9%	16.8∼18.1%	1.93∼2.07mol	77.2∼82.8g/kg

이것을 가수분해 조건으로 하여 50%NaOH를 변화 시켜가면서 단백질을 가수분해 했을 때 총 아미노산 농도를 계산하면 아래와 같은 결과를 얻을 수 있었다.

	concentration of aminoacid(mol/l)
50%NaOH 5 wt%	0.09	Fig. 1
50%NaOH 10wt%	0.11	Fig. 2
50%NaOH 15wt%	0.16	Fig. 3
50%NaOH 20wt%	0.55	Fig. 4

Fig .   The analytical result of hydrolyzed amino acid

at 50%-NaOH  5 wt% by HPLC

Fig 4.  The analytical result of hydrolyzed amino acid

at 50%-NaOH  10 wt% by HPLC

Fig. 2. The analytical result of hydrolyzed amino acid

at 50%-NaOH  15 wt% by HPLC

Fig 4.  The analytical result of hydrolyzed amino acid

at 50%-NaOH  20 wt% by HPLC

3.2. 살균성능실험

단백질 알칼리 가수분해에 의해 생성된 아미노산을 이용하여 구리착물 살균제를 합성한후 이것을 7ppm과 3.5ppm을 투여 했을 때 시간의 경과에 따라 살균력시험을 했을 때 아래 Fig5와  Fig6과 같은 우수한 결과을 알수

있었다.

Fig  Batericide action of Synthesized disinfectant at 7ppm

Fig 6 Batericide action of Synthesized disinfectant at 3.5ppm

4. 참고도서

1. US4443540 Munir Chervan et al: PROTEIN HYDROLYSIS                Apr.17.1984

2. Michael M. Darj and Mallnowski"Complexation between Copper(Ⅱ)      and Glycine in Aquous Acid Solutions by Window Factor Analysis      of Visible Spectra  Anal.Chem, 1996, 68, 1593-1598

3. M. Labanowska, K.R. Zurowski, E. Bidzinska: "Electron paramagnetic    resonnance investigations of ammonia and aniline copper(Ⅱ)            complexes" ELSEVIER COLLIDS AND SURFACES 1996 129-301

4. Tamotsu sugimori, Hideki Masuda, Nayumi Ohata, Kouji Koiwai,        Akira Odani, Osamu Yamauchi : Structrural Dependence of Aromatic     Ring Stacking and Related Weak Interactions in ternary Amino         Acid-Copper(Ⅱ) Complexes and Its Biological Implication" Inorg.        Chem, 1997, 36, 576-583

5. Inami T; Yamashita S WO97/30057; Antibacterial amino acids,           inorganic sallts there of and process for the precipitation and use       there of.

6. US00RE35458E Azuara: PROCESS TO OBTAIN NEW MIXED          COPPER AMINOACIDATE COMPLEXES FROM PHENATHROLIN

ES TO BE USED AS ANTICANCERINGENIC AGENTS Feb. 18.       1997

7. T.E. Hugli and S. Moore, J. Biol. Chem. 247:2828(1972)