섬유성바이오매스를 이용한 초산생산

우창호, 최실호, 박준호, 윤현희

경원대학교 화학공학과

Acetic acid Production from Cellulosic Biomass

Chang Ho Woo, Sil Ho Choi, Jun Ho Park, Hyon Hee Yoon

Department of Chemical Engineering, Kyungwon University

서론

Acetic acid는 가장 중요한 유기산 중의 하나이며 현재 식품과 화학제품의 주부원료로 광범위하게 사용되고 있다. Acetic acid의 년간 생산량이 2-3%씩 증대되고 있는데 특히 최근에는 염화칼슘 대체제로서 저부식·저공해 제설제인 CMA생산이 년간 수백만톤 규모의 잠재적 수요로 인해 acetate 생산량이 더욱 증대될 것이다1). 현재는 비록 거의 대부분 석유화학 유도체로부터 생산되고 있으나 homo acetate 발효를 이용한 acetic acid 생산도 상당한 관심을 받고있다. 발효경로의 장점은 비재생자원(석유)보다는 재생자원(섬유성바이오매스)에 의존한다는 것이다.

그램-양성 호열성 혐기균주인 Clostridium thermoaceticum은 육탄당(glucose, fructose)과 오탄당(xylose)을 포함한 다양한 기질을 acetic acid로 전환할 수 있는 성질을 가지고 있기 때문에 acetic acid 생산균주로 상당한 관심을 받고 있다. Homoacetate 발효와 관련된 두 가지 커다란 비용요소는 원료비용과 정제비용이다. 높은 정제비용은 acetic acid에 의한 강한 저해작용 하에서 생산되는 낮은 acetate농도 때문이다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 연구가 진행중인데 하나는 균주의 acetate에 대한 내성을 증대시키는 것이며 다른 하나는 membrane filtration이나 용매추출과 같은 새로운 분리방법을 찾는 것이다2). 미생물 발효방법에 의한 acetic acid 생산의 주원료는 전분유래의 glucose이며 이것은 식품으로도 사용될 수 있기 때문에 가격이 비싸고 결과적으로 acetic acid의 생산원가를 높이는 원인이 되고 있다. 따라서 풍부한 섬유성바이오매스 자원을 대체원료로 사용한다면 acetic acid 생산의 경제성을 높일 수 있을 것이다. 섬유성바이오매스로부터 acetic acid를 생산하기 위해서는 cellulose를 효소당화하여 glucose로 전환하고 이를 acetic acid로 발효시키는 공정이 요구된다. 동시당화발효(Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF)는 이와 같은 효소반응과 발효반응을 동시에 한 개의 반응기에서 수행하는 것으로 효소사용량을 최소화하고 공정이 단순화되는 장점을 갖고있으며 최근에는 에탄올 생산공정과 lactic acid 생산공정에서 그 효과가 입증되고 있는데 아직까지 acetic acid 생산공정은 거의 보고된 바 없다3).

본 연구에서는 최적의 SSF 조건을 찾기 위해서 효소가수분해반응과 발효반응 각각에서의 최적조건 즉, pH, 온도, 효소투입량, product inhibition 등의 영향을 평가하였다.

재료 및 방법

효소 및 균주

효소는 Trichoderma reesei 변이균주에 의해 생산된 상업용 효소인 Celluclast 1.5L과 중성효소인 Novozym 342를 사용하였다. Celluclast 효소는 Aspergillus niger 균주에 의해 생산된 Novozym-188(□-glucosidase)을 4:1의 비율로 혼합하여 사용하였다. Celluclast 효소의 활성도는 95 IFPU/ml 이었다. 균주는 동결 건조된 Moorella thermoacetica (formerly Clostridium thermoaceticum, ATCC 49707)를 American Type Culture Collection으로부터 분양 받아 Reinforced Clostridial Medium에 적응 배양시킨 후 acetate에 대한 내성을 높이기 위해서 3% sodium acetate가 첨가된 배지로 3일마다 계대배양하였다.

발효배지

발효배지조성은 ① 5 g/L Yeast extract, ② Phosphate solution [9 g/L KHCO3, 1.4 g/L K2HPO4, 1.1 g/L KH2PO4], ③ Salt solution [1g/L (NH4)2SO4, 0.25 g/L MgSO4·7H2O, 0.04 g/L Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O, 0.03 g/L CoSO4·7.5H2O, 0.0033 g/L Na2WO4·2H2O, 0.0024 g/L Na2MoO4·2H2O, 0.00024 g/L NiCl2·6H2O, 0.00029 g/L ZnSO4·7H2O, 0.000017 g/L Na2SeO3, 0.1% Resazurin indicator 1ml/L], ④ 0.25 g/L Cysteine·HCl·H2O, ⑤ □-cellulose[glucose ; variable]이다1). 배양액은 멸균도중 카라멜화 등의 부반응을 억제하기 위해서 항상 5가지로 각각 분리해서 준비하고 121℃에서 20분간 멸균했다.

발효 및 분석

Stock culture는 10ml 배양액을 포함한 12ml의 Hungate tube에서 유지되며 3일마다 배지를 바꾸어 주었다(접종량 : 0.5-1ml/10ml 배양액). 접종된 tube는 55℃에서 36시간 배양 후 100ml의 배양액이 들어있는 flask로 옮겨져 48시간 더 배양된 후 1L의 batch 발효조에 접종됐다4). 반응기는 New Brunswick, Bioflo Ⅲ를 사용했으며 발효 중에도 계속해서 CO2 가스를 불어넣어 혐기조건을 유지하였으며 pH 조절은 5N NaOH를 사용하였다. 유기산 및 당성분은 isocratic mode에서 BioRad HPX-87H column을 사용하여 HPLC로 분석했다. 이동상은 0.005M H2SO4이며 column 온도는 65℃ 이었고 유속은 0.6 ml/min 이였다.

결과 및 토론

초산발효

초산발효와 효소가수분해반응을 동시에 효과적으로 수행하기 위해서는 초산발효균주와 가수분해효소의 최적 활성조건이 유사하여야한다. 따라서 본 실험에서는 초산발효에서 pH와 온도의 영향을 조사하였다. Fig. 1은 pH 7.0에서 온도에 따른 초산발효성능을 나타낸 것이다. 발효온도가 높을수록 지연시간이 짧고 발효속도가 빠르며 수율 또한 높게 나타났다. 발효온도 60℃, 55℃, 50℃에서 초산수율이 각각 87, 81, 58% 이었다. Fig. 2는 pH의 영향을 나타낸 것으로, pH 7.0에서 pH 6.0으로 낮아지면 약간의 초산수율 증가를 보였으나 동시에 지연시간이 pH감소와 함께 증가함을 나타내고 있다. 대체적으로 pH 7.0∼6.0 사이에서 균주의 활성이 pH에 따라 크게 변하지 않는 것으로 관찰되었다. 초산발효실험에서  종종 균주의 사멸기동안 공급되는 영양분이 불충분할 경우 acetic acid 대신 부산물로 lactic acid가 생성되는 것도 관찰되었다.

효소가수분해

초산발효실험에서 적절한 발효온도는 60-55℃이며 pH는 7.0-6.0으로 조사되었다. 따라서 이와같은 온도 및 pH 범위에서 활성을 갖는 섬유소 가수분해효소를 탐색하였다. Fig. 3는 Celluclast 1.5L과 Novozym 342를 사용하여 □-cellulose의 가수분해실험을 수행한 결과로서, 반응온도 및 pH에 따른 digestibility를 나타낸 것이다. 본 실험의 범위에서(온도 50-55℃, pH 5.5-6.5), Celluclast 효소는 낮은 온도(50℃)와 낮은 pH에서 높은 활성을 나타내었다. 반면에 Novozym 342 효소는 pH의 영향이 미미하였다. 그러나 전반적으로 Celluclast 효소의 활성이 Novozym 342 효소에 비하여 우수한 것으로 나타났다. Celluclast 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 4.8∼5.0, 50℃ 이었다. 그러나 효소가수분해와 발효조건을 동시에 고려할 때 55℃, pH 6.0에서의 SSF가 가장 적절한 것으로 사료된다. pH를 5.0으로 더 낮게하면 효소활성도는 상당히 증가하겠지만 acetic acid중 free acid가 증가하여 acetic acid의 저해작용이 심각해질 것으로 판단된다. 이와 같은 가수분해효소는 섬유성바이오매스로부터 acetic acid를 생산하는데 드는 비용의 상당부분을 차지한다. 일반적으로 초기효소 투입량이 많을수록 가수분해속도는 빨라지고 최종수율도 높아지지만 전체효소투입량과 반응속도, 최종수율은 경제적인 관점에서 서로 상반되는 관계를 가지고 있기 때문에 이를 적절히 조절할 필요가 있다. 따라서 SSF에 적절한 효수 투입량을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. Fig. 4는 효소의 투입량에 따른 digestibility를 관찰한 것이다. Fig. 4에 나타난 바와 같이 단순한 효소가수분해에서 최적의 효소사용량은 약 50 IFPU/g cellulose로서 상당히 많은 양의 효소가 요구된다. 이것은 가수분해반응에서 glucose의 inhibition이 중요한 요인이 되기 때문이다. 따라서 SSF를 적용한다면 가수분해에 의해 생성된 glucose가 균주에 의해 바로 소모됨으로 glucose inhibition이 감소되어 효소사용량을 최소화할 수 있을 것이다.

동시당화발효

Glucose를 기질로한 초산발효실험과 효소당화실험에서 관찰한 반응온도 및 pH 조건을 고려하여 결정한 55℃와 pH 6.0에서 SSF실험을 수행하였다. Celluclast 효소 50 IFPU/g cellulose를 사용한 회분식 SSF를 1L용량의 반응기에서 수행한 결과를 Fig. 5에 나타내었다. SSF의 초기에는 glucose 축적이 상당량 있는데 이는 초기 SSF에서 균주의 성장지연 때문이며 이후에는 glucose 생산속도가 전체 공정의 속도결정단계가 되었다. 55℃와 pH 6.0에서 효소가수분에 의한 digestibility가 58% 정도이고 발효에 의한 초산수율이 81%인 것과 glucose inhibition이 거의 없는 것을 고려하면 SSF에 의한 acetic acid 수율이 47%이상 되어야 하는데 22%정도로 매우 적은 결과를 보였다. Acetic acid가 발효균주 뿐만 아니라 가수분해효소의 활성에도 상당한 저해작용을 하는 것으로 판단된다.

Acetic acid Inhibition

Fig. 6은 acetic acid를 각각 0, 5, 10, 20 g/L 첨가하고 발효실험을 flask task로 수행하여 반응시간에 따른 발효용액내의 glucose 소모속도를 나타낸 것이다. Fig. 6에 나타난 바와 같이 acetic acid를 첨가하지 않은 경우에는 80시간만에 glucose가 전부 소모되었다. 그러나 10 g/L이상의 acetic acid가 발효초기부터 첨가된 경우에는 glucose 소모가 거의 없는 것을 관찰할 수 있다. 따라서 발효에 있어서 acetic acid의 저해 작용이 상당히 큰 것을 알 수 있었으며 SSF를 효과적으로 조업하기 위해서는 SSF 도중 생성된 acetic acid를 제거시키는 공정이 필요한 것으로 판단되며 이를 위해서 현재 kerosene에 TOPO를 용해시킨 solvent를 이용한 acetic acid 추출실험과 resin을 이용한 acetic acid 흡착실험을 수행하고 있다.

참고문헌

[1] Ljungdahl, L. G.: in 'Organic Chemicals from Biomass', Wise D. L., ed., Benjamin/Cummings Co., Menlo Park, CA(1983).

[2] Han, I. S., Cheryan, M.: App. Biochem. & Biotechnol., 57/58, 19-28(1996).

[3] Takagi, M., Abe, S., Suzuki, S., Emert, G. H., and Yata, N.: in Proceedings of the Bioconversion Symposium, IIT, Delhi, Ghose, T. K., ed., 551(1977).

[4] Parekh, S. R., Cheryan, M.: Process Biochem., 25, 117-121(1990).

Fig. . Effect of temp. on the 2wt% acetic acid fermentation at pH 7.0.

Fig. . Effect of pH on the 2wt% acetic acid fermentation at 55℃.

Fig. . Effects of pH and temp. on the enzymatic digestibility.

Fig. . % digestion of □-cellulose using Celluclast.

Fig. . Batch SSF with 2wt% □-cellulose at pH 6.0 and 55℃.

Fig. . Product inhibition on acetic acid fermentation at pH 6.0 and 55℃.