재조합대장균주로부터 사람 인터루킨-2의 정제

원혜순, 이운영, 이지원／, 김인호

충남대학교 화학공학과, ／생명공학연구소 생물공정RU

Purification of Recombinant Human Interleukin-2

Hye-Soon Won, Woon-Young Lee, Jee-Won Lee／, In-Ho Kim

Dept. of Chem. Eng, Chungnam National University, ／KRIBB Bioprocess RU

서론

인터루킨-2(IL-2)는 면역조절에 관여하는 단백질로서, T세포 성장인자(TCGF)라고 알려져 있다. 분자량이 약 15000인 단백질로서 T세포를 증식시키고, B세포를 자극시키는 활성이 있으며 또, T세포에 작용하여 □-인터페론을 분비시키는 작용을 한다(1).

재조합 DNA 기술에 의해 합성한 사람의 IL-2를 정제하고자 대장균을 숙주로 하여 생산된 사람의 IL-2를 불용성의 봉입체(inclusion bodies)의 형태(2)에서 정제하였다. 이 봉입체는 대개 변성 용매에 변성된 형태로 용해시킨 후, 리폴딩 과정을 거쳐 정제하게 된다. 다음 고순도 정제과정에서는 역상 HPLC(RP-HPLC)를 주요한 정제수단으로 사용한다(3). 본 실험에서는 RP-HPLC로 IL-2를 정제한 결과를 보고하고자 한다.

실험

사용균주

실험에 사용된 대장균 균주는 glucagon 3분자가 tag된 IL-2로 생명공학연구소에서 세포를 파쇄한 형태로 공여받았다.

세포 봉입체(Inclusion Bodies), IB의 용해

Cell homogenate를 5000g에서 30분간 원심분리하였다. 상등액은 따라내고, 0.05(w/v)% NaOH, pH12를 가해 상온에서 2시간 반응시킨다. 5000g에서 30분간 다시 원심분리한 후 상등액의 전기영동을 실시하였다.

단백질정량

단백질 정량은 Bradford 방법을 사용하였다.

이온교환크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography, IEC)

3ml의 CM-cellulose(Chisso corp. Japan)젤을 1cm×10cm의 컬럼에 채워 사용하였으며,  컬럼은 0.05M phosphate buffer, pH 6으로 평형을 이루었다. 시료는 pH를 6으로 조정하여 9ml를 주입하였다. 탈착은 0∼1M NaCl의 선형구배로 실시하였고 유속은 0.2ml/min이었다.

단백질 원형재생(Refolding)

단백질의 원형재생은 변성된 봉입체 용액을 투석하여 실시하였다. 0.1M phosphate buffer, pH 8의 완충용액을 이용하였으며 투석 후 침전된 물질은 5000g, 30min에서 원심분리로 제거하였다. 이 용액을 RP-HPLC의 시료로 사용하였다.

RP-HPLC

재생된 시료는 RP-HPLC에 의해 분리하였다. 컬럼은 25cm×4.6mm 규격의 Kromasil C8(Eka Nobel, Sweden)를 사용하였으며, Waters사의 UV-검출기(Model 440)를 사용하였다. 검출파장은 254nm이었다. 펌프는 영인과학 제품(Model 910)을 사용하였고 유속은 0.5ml/min이었고 시료주입량은 20□l였다. 물과 혼합된 10-100% 아세토나이트릴의 선형구배를 이용하여 단백질을 용리시켰다.

전기영동(SDS-PAGE)

12.5% 아크릴아마이드 젤을 사용하였다. 샘플 완충용액의 조성은 60mM Tris-HCl, pH6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue이다. 분자량 표준물질로 BSA(분자량 67,000), ovalbumin(분자량 45,000), pepsin(분자량 34,700), lysozyme(분자량 14,400)을 사용하였다. 젤은 coomassie brilliant blue로 염색하거나 은염색하였다.

결과 및 고찰

IB의 용해와 원형재생

NaOH로 녹인 후, 투석에 의해 pH를 변화시켜서 단백질의 원형재생을 하였다.  결과를 전기영동으로 분석하여 Fig.1에 나타내었다. 그림에서 보는 바와 같이 변성된 상태와 재생된 상태에서 IL-2의 밴드의 두께의 차이로 보아 재생되는 동안 단백질의 손실이 있음을 알 수 있었다. 각 단계의 단백질양을 Table 1에 나타내었다.

IEC

양이온 교환젤을 사용하여 이온교환크로마토그래피를 실시한 결과를 Fig.2에 나타내었다. 크로마토그램에서 볼 수 있듯이 약 0.4M의 NaCl에서 IL-2가 탈착되었다. 이 부분의 분획을 모아 전기영동을 한 결과가 Fig.3에 나타나 있다. Fig.1과 비교하여 보면 분자량 변화가 있고 정제과정 중 IL-2의 집합체(aggregate) 형성이 일어난 것을 알 수 있었다.

RP-HPLC

RP-HPLC를 수행한 결과를 Fig.4에 나타내었다. 세 개의 주요한 피크가 관찰되었다. 이것은 모두 IL-2로 집합체를 형성하고 분자량이 더 큰 IL-2가 상대적으로 늦게 용출되는 것으로 생각되며 각각 47%, 60%, 73%의 아세토나이트릴 조성에서 용리되었다. 이 세 성분의 순도는 97.38%가 된다.

결론

대장균으로부터 발현된 재조합 사람 IL-2를 간단한 방법으로 정제하여 보았다. 원형재생 과정에서 단백질 손실이 많았고, 시간이 지남에 따라 집합체 형성이 증가하므로 단시간 내에 정제를 수행하여야 한다. 양이온교환크로마토그래피를 통한 정제효과는 크지 않은 것으로 생각된다. RP-HPLC는 IL-2의 정제에 효과적이었고 집합체를 형성한 IL-2도 분리할 수 있었다.

참고문헌

1. Morgan et al. : Science, 193, 1007(1976).

2. Devos et al : Nucleic Acids Res. 11, 4307-4323(1983).

3. Weir et al : Biochem. J.  245, 85-91(1987).

Table  Purification yield of IL-2

	Total protein (mg)	Total volume (ml)	Yield(%)
Cell homogenate	3.103	5	-
Solubilization of IB	2.265	5	100
Renaturation by dialysis	1.836	10	81.1

Fig.1 SDS-PAGE of IB using 12.5% acrylamide gel. Lane 1: molecular weight marker, lane 2,3: supernatant of cell homogenate, lane 4,5: denatured form of IL-2, lane 6,7 : renatured form of IL-2. The molecular  weight of G3IL-2 is about 30k.

Fig. 2 Cation exchange chromatogram. equilibrium buffer : 0.05M phosphate buffer, pH 6, elution : 0-1M NaCl linear gradient, sample loading volume : 9ml,  elution fractions are collected and SDS-PAGE done.

Fig. 4 Chromatogram of RP-HPLC, mobile phase is 10-100% linear gradient of acetonitrile in water, sample injection:20□l, the retention times of three peaks are 9.31, 11.98, 14.57 min.

Fig.3 SDS-PAGE of IEC fractions, 12.5% acrylamide gel, lane 1,10: molecular weight marker, lane2-9: elution fractions of cation exchange chromatography.