백색부후균에 의한 Pentachlorophenol(PCP)의 생분해

류원률, 심성훈, 조무환, 김현수*, 오광근*, 전영중*

영남대학교 화공학부, 제일제당(주) 종합기술원*

Biodegradation of Pentachlorophenol(PCP) by White Rot Fungi

Won-Ryul Ryu, Seong-Hoon Shim, Moo-Hwan Cho, Hyun-Soo Kim*, Kwang-Keun Oh*, Yeong-Joong Jeon*

School of Chemical Engineering & Technology, Yeungnam University

Institute of Technology & Science, Cheiljedang Corporation*

1. 서 론

Pentachlorophenol(PCP)로 대표되는 염소화 페놀화합물(chlorinated phenols)은 생물체에 대한 광범위한 영향력으로 인하여 농약제조, 섬유산업, 페인트산업, 목재보존 등에 폭넓게 사용되는 살충제의 주성분이다. PCP는 0.6□/□로 대부분의어류에 치명적인 급성 독성화합물로서 페놀에 비해 약 40배의 독성을 보이고, 페놀화합물은 염소화 정도가 클수록 상대적 독성도 커지는 경향을 나타낸다. 따라서 PCP는 이러한 광범위한 독성 및 지하수, 토양 등에 잔류성으로 인하여 환경오염물질로 주목되고 있다. 미생물에 의한 PCP의 분해는 Arthrobacter sp., Flavobacterium sp., Mycobacterium sp., Pseudomonas sp. 등의 세균을 이용한 연구가 보고되고 있고 또한 균류를 이용한 연구가 보고되고 있는데 지금까지 균류는 주로 식품, 의약품으로서 자실체를 이용하고 있으며, 산업폐수 및 유해환경오염물질의 처리 등 환경적인 측면에서는 활용이 미미한 실정이다. 백색부후균은 lignin을 분해할 수 있는 lignin peroxidase를 분비하는데 기질 특이성이 매우 낮아 다양한 종류의 오염물질 즉 phenolic compound를 분해하는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 현재까지는 주로 Phanerochaete chrysosporium을 대상으로 연구가 진행되어 왔다. 그러나 다른 여러 종류의 백색부후균들도 lignin peroxidases 및 기타 효소들을 보유하고 있기 때문에 본 연구에서는 Phanerochaete chrysosporium외에 자연계에서 분리한 Trametes sp., Pleurotus sp. 등을 이용하여 PCP의 분해능력과 효소활성과의 관계 등을 비교함으로써 향후 PCP 등 난분해성 물질의 생물학적 처리에 대한 응용가능성을 검토하고자 하였다.

2. 실 험

균주 및 시약

본 연구에서는 Phanerochaete chrysosporium(IFO 31249), 국내에서 분리한 Trametes sp., Pleurotus sp. 등 3종류의 백색부후균을 사용하였다. 균주는 YMPG 배지(yeast extract 3g/L, malt extract 3g/L, glucose 10g/L, peptone 5g/L, agar 17g/L)의 사면배지에서 각각 39, 28, 28oC로 배양한 후 4oC에서 보관하였다.

배지조성 및 배양방법

상기의 P. chrysosporium, Trametes sp., 및 Pleurotus sp.의 선단을 수술용 칼날(정사각형 6□×6□)로 취하여 YMPG평판배지의 중앙에 접종하였으며, 항온기에서 1주일 동안 배양하였다. 그후 종균용 평판배지에서 배양된 균사체의 선단을 앞에서와 같이 취하여 한천을 제외한 같은 조성의 액체배지 100□를 함유하는 300□ 플라스크에 접종하여 각각 39, 28, 28oC의 항온기에서 7일간 배양하였다.

Flask배양에서 PCP의 분해

균체농도를 높이기 위한 영양풍부배지에서 배양한 액체배양액을 5,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 얻어진 균사체를 배지성분과 분리하고 멸균증류수로 2∼3회 세척하는 과정을 2회 반복하여 YMPG배지 성분을 제거한 후 homogenizer로 균질화하여 Table 1의 PCP를 함유한 질소제한배지에 10%(V/V)씩 접종하여 300□ 삼각플라스크에서 shaking incubator(Vision, K.M.C.-8480)를 사용하여 150rpm으로 15일간 배양하였다. 이때 별도의 산소의 주입은 없었으며, 대기중의 공기만이 산소의 공급원이 되도록 하였다.

PCP 분석방법

적정시기가 지난 후 배지로부터 시료 3□를 취하고 필터(0.22□)로 여과한 후 hexane 3□와 1M HCl 0.1□를 첨가하고 교반한 후 추출하였다. 추출된 PCP의 분석은 GC/FID(Shimadzu GC-14A)로 분석하였으며 칼럼은 CBP5 (25m×0.22□×0.25□)를 사용하였다. 주입구의 온도는 250oC, 검출기의 온도는 280oC로 지정하였으며 분석온도의 설정은 다음과 같다.

80℃(1min) □□□□□□□□□□>180℃□□□□□□□□□□□>200℃□□□□□□□□□□□>280℃(1min)

initial     20℃/min        4℃/min         20℃/min      final

효소의 활성 측정

액체배양배지(NLM배지)에서 1□의 표본을 취하여 원심분리기에서 4℃, 15,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상등액을 분광광도계를 이용하여 lingnin 분해효소의 활성을 측정하였다. 균주에서 분비되는 효소인 lingnin peroxidase, Mn(Ⅱ)-dependent peroxidase의 분석은 Bumpus1)의 방법을, laccase의 분석은 Coll2)의 방법을 이용하였다.

Crude enzyme을 이용한 PCP의 분해 확인

Crude enzyme을 함유한 배양액을 이용한 PCP의 분해실험은 다음의 2가지 방법으로 행하였다. 반응용액으로 crude enzyme을 함유한 배양액과 PCP, 그리고 효소가 최대활성도를 가지는 buffer solution과 H2O2를 함께 넣었을 경우와 crude enzyme을 함유한 배양액과 PCP만을 섞었을 경우 두 가지로 실험하여 비교해 보았다.

결과 및 토론

Lignin peroxidase는 영양성분이 결핍된 상태에서 생성되며 비기질적 특성으로 인하여 PCP 등 여러 가지 오염물질을 분해하는데 일반적으로 유해물질류는 곰팡이의 성장을 억제한다. 그래서 1차적으로 풍부영양배지에서 성장시킨후 PCP를 각각 30, 80ppm 첨가한 질소제한배지로 교체하였다. 각각의 백색부후균이 PCP를 분해하는 경향은 Fig. 1과 2에 나타내었다.

PCP산화반응의 대표적인 중간체는 TCBQ(tetrachloro benzoquinone)로 보고되고 있으며 여러 단계의 radical 반응을 거쳐 최종적으로 이산화탄소와 물로 전환된다고 알려져 있다. P. chrysosporium의 경우 30ppm의 PCP를 15일만에 75%이상을 분해하였으며, Trametes sp.은 67%, Pleurotus sp.도 75%정도 분해하였다. 80ppm의 PCP의 경우 P. chrysosporium은 87.3%, Trametes sp.은 71.9%, Pleurotus sp.는 85.9%정도 분해하였다. 그러나 균주에서 일반적으로 분비되는 lignin peroxidase(LiP), manganese peroxidase(MnP), laccase 등의 lignin peroxidase는 검출되지 않았다. 일반적으로 리그닌 분해효소에 의해 여러 유해물질을 분해하는 것으로 알려져 있지만 본 실험에서는 Dhawale 등3)의 PAH 분해 연구 결과와 일치하게 nonligninolytic conditions에서도 PCP를 분해하였다. 일반적으로 PCP는 균체표면에 잘 흡착되는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서도 질소제한배지로 교체 직후 초기의 PCP 농도가 급격히 감소된 것은 곰팡이의 표면에 흡착되었기 때문이라 여겨진다. 그러나 Fig. 1,2에서와 같이 시간이 경과함에 따라 세포벽에서 분리되어서 서서히 분해가 되고 있음을 보여주고 있다. 최종적으로 분해된 PCP의 양을 알기 위하여 Table 2에서 보는 바와 같이 배양 15일후 균체를 균질화시켜 균체벽에 흡착된 PCP를 추출하여 분석한 결과 균체벽에는 최대 4.5ppm만이 남아 있을 뿐 초기 흡착되었던 PCP가 거의 모두 분해된 것을 볼 수 있었다.

또한, crude enzyme을 함유한 배양액을 이용하여 PCP의 분해정도와 각각의 효소와의 상관관계를 알아보기 위하여 실험한 결과는 Table 3과 같다. Table 3에서 보는 바와 같이 효소와 PCP만을 반응시켰을 때에는 전혀 분해가 이루어지지 않았다. 그러나 buffer solution과 H2O2를 같이 투입하였을 때에는 어느 정도 분해가 되는 것을 볼 수 있다. 이는 효소가 작용하기 위해서는 H2O2가 개시제로 필요하며 pH 조건이 중요하다는 것을 알 수 있다. 또한 3가지의 효소 중 lignin peroxidase(LiP)가 가장 뛰어난 분해 효과를 보이는 것을 알 수 있다. 그리고 각 유해물질별 분해율과 효소의 활성도를 도식해 보면 각 유해물질의 분해율과 리그닌 분해효소의 활성도는 거의 선형적으로 비례함을 알 수 있다. 따라서 앞으로의 연구 방향은 최대의 활성도를 가지는 lignin peroxidase(LiP)의 최적 생산 조건을 확립하는데 있다.

참고문헌

1. John A. Bumpus, Biodegration of polycyclic aromatic hydrocarbons by        Phanerochaete chrysosporium" :  Appl. and environmantal microbiology, 55(1), 154    ∼158, (1989)

2. Pedro M. Coll, Jose M. Fernandez-abalos, and Pilar Perez : "Purifition and    Characterization of Phenoloxidase(Laccase) from the Lignin-Degrading          Basidiomycete PM1(CECT 2971)" Appl. and environmantal microbiology, 59(8),     2607∼2613, (1993)

3. Shrikrishna W. Dhawale, Shree S. Dhawale and Deborah Dean-ross :          "Degradation of Phenanthrene by Phanerochaete chrysosporium occurs under      ligninolytic as well as nonligninolytic conditions", Appl. and environmantal      microbiology, 58(9), 3000∼3006, (1992)

Table 1. Composition of culture media for white rot fungi.

Medium composition

The following items are added per □ of cultures;

10% Glucose  200mL

4% Ammonium Tartrate  100mL

Basal Medium(/liter, KH2PO4 20g,  MgSO4 5g,  CaCl 1g)  100mL

2,2 dimethyl Succinic Acid  3.7g

1Tracer element solution  10mL

100ppm Thamine·HCl  1mL

100ppm Biotin,  1mL

1Tracer Sol'n (/liter);

nitrilotriacetate 1.5g,  MgSO4·7H2O  0.5g,  NaCl  1.0g,

MnSO4·H2O  0.5g,  FeSO4·7H2O  0.1g,  CoCl2·6H2O 0.1g,

ZnSO4·7H2O  0.1g, H3BO3  10mg,  CuSO4·5H2O  0.1g,

AlK(SO4)2·12H2O  10ml,  Na2MoO4·2H2O  10mg

Fig. 1. Biodegradation rate of 80 ppm PCP by P. chrysosporium at 39oC, and Trametes sp. and Pleurotus sp. at 28oC.

Fig. 2. Biodegradation rate of 30 ppm PCP by P. chrysosporium at 39oC, and Trametes sp. and Pleurotus sp. at 28oC.

Table 2. Concentrations of PCP after 15days culture.

Strain	Time	Remained PCP concentrations(ppm)
		Initial PCP conc. : 80ppm		Initial PCP conc. : 30ppm
		Extracellular	Mycelia	Extracellular	Mycelia
Phanerochaete sp. Trametes sp. Pleurotus sp.	15days 15days 15days	10.2 22.5 11.3	4 3.1 4.5	7.2 9.8 7.48	1 1.5 1.4

Table 3. Degradation of PCP using crude enzyme solution.

Enzymes	LiP				MnP	laccase (no H2O2)
Activity (U/L)	50	100	300	500	50	50	100	200	300
Crude enzyme + PCP + Buffer + H2O2	5.6	21	42.5	54	0	0	6.2	8.8	20
Crude enzyme + PCP	0	0	0	0	0	0	0	0	0