Permeabilized Paracoccus Denitrificans의 반복탈질 특성연구

김선화, 박근호, 송주영

창원대학교 공업화학과

A Study on the Repeated Denitrification Characteristics of

permeabilized Paracoccus denitrificans

Sun Hwa Kim, Keun Ho Park, Ju Yeong Song

Dept. of Chem. Tech., Changwon National University, Changwon 641-773,

서론

본 연구에서는 P. denitrificans를 toluene를 이용하여 permeabilization 시키고 처리균주와 미처리 균주의 탈질역가를 비교한 후 회분식 반응기 내에서 처리균주의 반복 탈질역가 특성을 비교하였다.  처리균주는 미처리균주에 비하여 우수한 탈질능력을 보였으며, 톨루엔으로 처리한 균주는 미처리 균주에 비해 배지액 내에서의 성장시 적응기는 길었지만 지수성장기는 짧은 것으로 나타났다. 회분식 반응기에서 탈질반응을 수행할 때 주기적으로 영양소의 공급이 이루어지면 처리된 균주는 지속적인 탈질능력을 보였다. 이상의 결과로 permeabilization 처리한 균주를 실제 폐수처리에 적용시키면 폐수는 지속적인 영양공급원이 될 수 있기 때문에 지속적으로 탈질처리를 해낼 수 있는 가능성을 얻었다.

실험장치 및 방법

균주의 배양 및 화학적 permeabilization

P. denitrificans를 2차 배양한 후,  배양된 균주를 2000 rpm의 속도로 원심분리 시킨 다음 상층액은 버리고, 멸균된 완충용액으로 수세시킨 다음 다시 2000 rpm의 속도로 원심분리 시킨다. 이런 수세과정을 2번 거친 후 균주액 (50 mg/L)을 유기용매의 농도별, 처리 시간별로 permeabilization 시켰고, 1분에 300회 흔들어 처리하였다. 톨루엔의 농도는 각각 5, 10, 20(v/v%)농도로 변화시켜가며 실험하였고, 처리 시간을 10초에서 10분까지 변화시켜가며 실험을 하였다.

Permeabilized cells과 free cells의 탈질특성

처리된 균주와 미처리 균주의 탈질능력을 알아보기 위하여 회분식 반응기에서 탈질능력을 비교하여 보았다. Fig. 1과 같이 만들어진 반응기에 공정시험법에 의해 만들어진 질산성질소 100 mg/L용액을 희석시켜 20 mg NO3--N/L의 농도로 공급하였다. 균주의 농도는 약 10 mg/L의 농도로 공급하였고, 탄소원으로 메탄올은 1 g/L의 농도로 공급하였고, yeast extract는 0.1w/v%의 공급하였다. 6시간마다  시료를 약 2∼3 mL를 주사기로 취하여 0.2 □의 필터로 여과한 다음 질산성질소와 아질산성질소의 농도를 측정하였다.

Fig. 1. Schematic diagram of experimental apparatus for batch system.

Permeabilization 처리한 균주로써 1회 탈질실험 이후 처리된 균주가 연속적으로 탈질능력을 가지는지를 측정하기 위하여 질산성질소의 농도가 5 mg/L의 농도이하가 되면 100 mg/L의 질산성질소 용액을 주입시켜 반응기 내의 질산성질소의 농도가 약 20∼30 mg NO3--N/L의 농도가 되게 하였다. 또, 탈질공정을 4∼5회 수행한 균주가 기질의 고갈로 인하여 사멸기에 접어 들어간다고 판단될 때 기질의 농도를 초기의 조건으로 회복시켜 주면 다시 탈질공정을 수행하는지를 알아보기 위해 100시간 이후에 질산성질소와 메탄올, 효모추출물(yeast extract)를 초기 조건으로 회복시켜 반복 탈질 능력실험을 하였다.

결과 및 고찰

화학적 permeabilization

톨루엔에 의한  permeabilization은 Fig. 2에서 5% 톨루엔으로 처리하였을 때 단백질이 녹아 나와서 흡광도 차이를 0.1정도로 보이는 시간이 30초에서 1분 정도이며,  10% 톨루엔으로 처리하였을 때 높은 흡광도를 보이는 시간은 30초 정도임을 확인 할 수 있다.  20% 톨루엔으로 처리하였을 때 높은 흡광도를 보이는 부분은 10초를 전후에서 볼 수 있다. 아울러 permeabilization의 척도인 단백질 용출 정도는 흡광도 차이를 0.1정도 보이는 5%의 톨루엔으로 처리 시 permeabilization 처리가 잘 된다고 보여진다.

Permeabilized cells과 free cells의 탈질특성

Fig. 3은 미처리 균주로 탈질실험을 하였을 때 질산성질소 20 mg/L를 5 mg/L까지 처리하는데 대략 30시간이 소요되었다. 5% 톨루엔으로 1분간 처리한 균주와 5분간 처리한 균주로 탈질실험을 하였을 떄 5 mg/L까지 처리하는데 20시간

Fig. 2. Absorbance of permeabilized cells          by each concentration.

Fig. 3. Denitrification rate of free cells and   permeabilized cells treated with 5v/v % of    toluene for each time in a batch reactor.

Fig. 5. Denitrification ability of 1min and 5v/v% of toluene treated strains with repeated     recovery of initial NO3--N concentration.

Fig. 6. Denitrification ability of  1min and 5v/v% of toluene treated strains with repeated   recovery of initial NO3--N concentration and recovery of initial medium

concentration.

정도 소요되었다. 이는 미처리 균주에 비해 10시간 정도 단축된 것이다. 5% 톨루엔으로 15분간 처리시 약 24시간에서 5 mg/L까지 처리해 내었다.

미처리 균주가 처리하는 능력이 20 mg/L의 질산성질소를 처리하는데 약 50시간이 걸리는데 반하여 처리 균주는 동일 농도를 40시간이내에서 처리하였으며 처리 균주의 질산성질소 탈질능력이 우수함이 입증되었다. 처리 균주나 미처리 균주 모두 1회 처리 후 반복 처리 시는 상당히 빨리 탈질 처리하는 경향을 보이는데 이때는 균주가 지수성장기를 지나서 균주의 농도가 최대일  때이며, 미처리 균주는 3회까지는 8시간 정도만에 1회 처리를 하는 반면 4회 처리 시는 처리능력이 떨어짐을 보이는데 반하여 처리 균주는 4회 처리시도 비슷한 처리능력을 보였고 5회부터 처리능력을 잃어 가는 것으로 나타났다.

결론

본 연구에서 탈질화균인 P. denitrificans를 toluene으로 permeabilization시킨 후, 성장특성실험, 탈질실험, 반복 탈질 능력실험을 거쳐 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 톨루엔의 농도를 높일 경우 단백질이 용출되는 속도가 빨라지며 1%, 5% 톨루엔으로 처리하였을 때 permeabilization이 잘 되었다.

2. 반복적으로 초기농도를 회복시켜주면 지수성장기와 정지기 동안 많은 탈질능력을 보인다. 이는 균주의 농도가 최대로 증식되어 있기 때문인데, 다른 영양소의 공급이 없으면 균주는 사멸기에 들어가며, 별도의 영양소를 공급하면 다시 성장하여 탈질능력을 보인다.

참고문헌

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