고순도 Conjugated Linoleic Acid의 합성 및 분리정제에 관한 연구

홍준기, 한유리, 이성권, 최청송

서강대학교 화학공학과

A study on the synthesis, separation and purification of Conjugated Linoleic Acid

Jun-Kee Hong, Yu-Ri Han, Seong-Kweon Lee, Cheong-Song Choi

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

1978년부터 미국 위스콘신대학교의 Michael W. Pariza 교수 연구팀은 육류중의 단백질과 같은 유기물질 등이 가공중의 열변성에 의하여 유전독성을 일으키는 물질을 생성되리라는 가정 하에 살모넬라 변이균주를 이용한 돌연변이 시험법을 이용하여 시험하였다. 이 과정에서 쇠고기 육류의 열추출물 중에는 항돌연변이 작용을 갖는 물질이 있을 것이라고 생각하게 되었다. 대부분의 단백질 유래의 성분은 열 변성과정을 거쳐서 돌연변이 유발물질로 변화하는 것에 비하여 쇠고기 육류의 열변성 과정을 거친 분획 중에는 항돌연변이 성분이 있으며, 그것을 Conjugated Linoleic Acid(CLA라 명명함)이라는 것이 밝혀졌다. CLA의 합성을 위해서는 고순도의  Linoleic acid 분리정제가 필요하다. 지방산을 분리하는 일반적인 방법으로는 HPLC를 이용하는법, 요소수용액을 이용해 요소결정화법을 이용하는법, 초임계분리등이 있다. 그러나 HPLC나 초임계 추출장치를 이용하는 방법에는 고가의 장비가 필요하다는 점과 그 수율이 매우 낮다는데에 문제가 있다 하겠다. 또한 먼저 기존의 요소부가법은 요소의 분자군 크기를 제어하지 못한 관계로 냉각시 요소와 요소부가체가 동시에 결정으로 석출되어 요소의 활동도가 크게 저하되어 불필요한 지방산 및 색소, 과산화물을 제거할 수 없는 단점이 있다. 따라서 본 연구에서는 기존의 단점을 보완한 새로운 요소포접화합물 메카니즘을 다음에 제시하였다.

Linoleic Acid의 고순도 분리정제

실험을 시작하기 전 우선 식물유 즉 중성 지질의 지방산 전환이 필요하다. 중성지질의 지방산전환은 AOAC 방법에 준하여 실시했다. 이렇게 전환된 Linoleic acid를 메탄올-요소에 60∼70℃로 승온시켜 완전 용해시킨 후, 냉각시켜 최종온도를 20∼30℃로 조절하고, 이때의 adduct(원하는 지방산을 포접한 요소결정)를 여과하여 여액을 회수하고 메탄올을 증발시킨 후, 이때 요소 지방산 결정에서 요소와 헥산을 제거시킴으로써 순도 99% 이상 Linoleic Acid의 분리가 이루어진다. 이때, 지방산은 분할 주입하고, 얻어진 adduct는 지방산 양에 대해 물과 헥산을 혼합하여 요소를 수용액층으로 이동시켜 제거한 후, 윗층인 유기용매층 내에 Hexane을 제거시킨다. 이렇게해서 얻어진 Linoleic acid의 Gas Chromatography 결과는 Fig 1.에 나타낸 바와 같이 Oleic acid (0.2%), Linoleic acid (99.5%) 그리고 Linolenic acid (0.3%) 이었다.

Oleic Acid 가 포함된 지방산의 분리정제 특성

메탄올-요소-Oleic Acid를 용해시켜 냉각시킨 후, 요소포접화합물의 DSC 분해형태를 Fig 3. 에 나타내었다. 첫 번째 그림은 60℃에서 50℃까지 0.2℃/min으로 냉각하여 제조한 경우는 상전이 peak가 없고, 두 번째 그림 60℃에서 20℃로 냉각하여 제조한 경우는 약 16-℃에서 작은 peak가 존재함을 알 수 있었다. 또한 세 번째 20℃에서 -10℃로 냉각하여 제조한 경우는 매우 큰 상전이 peak가 20℃부근에서 존재함을 알 수 있었다. 이 그림으로부터 20℃에서 -10℃까지 냉각하여 제조한 요소포접화합물의 경우에 약 16℃에서의 상전이 열량이 가장 큼을 알 수 있었고 상대적으로 많은 양의 요소포접화합물이 Orthorhombic 구조를 갖음을 알 수 있다. 이는 Oleic Acid의 용융온도가 13℃이며 요소포접화합물을 형성하기 위한 Oleic Acid의 상태가 distortion된 구조를 먼저 형성한 상태에서 요소포접화합물을 형성하기 때문에 order-disorder phase transition을 거치지 않고 요소포접화합물을 형성하기 때문이다. 또한 앞에서 각각의 방법으로 제조한 Oleic Acid 요소포접화합물의 구조적 분석을 위하여 XRD를 이용한 것을 Fig 4. 에 나타내었다. 첫 번째 60℃에서 50℃까지 냉각하여 제조한 Oleic Acid 요소포접화합물의 경우에는 모든 peak가 Hexagonal 형태의 peak를 갖으며, 두 번째 60℃에서 20℃로 냉각하여 제조한 경우는 소량의 Orthorhombic peak 가 존재함을 알 수 있다. 그러나, 20℃에서 -5℃까지 냉각하여 제조한 경우에는 모든 주 peak 가 Orthorhombic peak 임을 확인할 수 있었다. 이러한 사실은 요소포접화합물 형성시 Oleic Acid의 분자군적 거동에 크게 좌우된다. 즉, 20℃에서 -5℃로 냉각되는 상태의 용액내 Oleic acid는 비회전성 및 고형화 성질을 갖은 상태이며 이 상태에서 요소가 Oleic Acid와의 요소포접화합물 형성은 ordering-disordering phase transition에 의한 orthorhombic 구조전이에 의한 것과 미리 변형된(distortion) Oleic Acid 분자군이 형성된 상태의 포접화합물 형성인 것이다.

새로운 UIC 메카니즘

Oleic acid의 상전이 온도를 피해야함은 위에서 설명하였다. 그러나 포화온도 20℃에서 조업을 중단하게 되면 용액내에 Oleic acid가 잔존하게 된다. 그러나, 20℃이하로 조업을 계속하게 되면 Oleic acid -UIC의 상전이 현상으로 인해 분자간의 부피팽창에 의해 결정간의 새로운 표면들이 형성된다. 이러한 고체 표면들의 활성화로 인한 반응성의 증가로 원하는 지방산(linoleic acid)의 손실을 유발한다. 이러한 것들을 방지하기 위해 20℃에서 원하는 지방산들을 UIC 형성시키기 위해 요소- MeOH-지방산 용액내 지방산을 분할 주입함으로써 UIC 분자군 형성 및 그 크기를 최대화하는 것이다. 이렇게 되면 Oleic Acid의 상전이를 피할 수 있고 고순도의 Linoleic acid를 분리정제 할 수 있다. McAdie에 의하면 요소포접화합물의 형성은 직쇄상 탄화수소 주위에서 요소가 Hexagonal로의 결정화와 Tetragonal로의 결정화가 경쟁하는 과정에서 보다 선택적으로 Hexagonal로 결정화되어 형성하는 것이라고 하였다. 용액내의 요소와 탄화수소가 극히 밀집되어 □포접화합물 유사구조"를 형성하고 있음은 최근에 밝혀진 사실이다. 따라서 요소포접화합물 형성은 탄화수소 주위에서 요소분자군이 형성되어 이들이 요소로의 결정화와 요소포접화합물로의 결정화가 경쟁하는 과정에서 형성된다고 할 수 있으며 냉각속도가 빨라 요소 분자군의 형성 및 성장속도가 빠르면 요소가 동시에 결정화 될 수 있다. 냉각속도를 빠르게 하는 과정에서 완전한 형태의 요소포접화합물을 얻기 위해서는 용액내의 요소포접화합물의 과포화도를 일정 수준으로 유지시켜 요소분자군을 요소의 결정화 보다 요소포접화합물로의 결정화가 지배적이 되도록 만들어 주어야 하며, 이를 위해서는 냉각과정에서 요소포접화합물을 형성할 수 있는 직쇄상의 유기화합물을 주기적으로 계에 주입하였다. 이러한 다단계 주입은 요소 분자군의 성장을 억제시켜 주며 용액 자체를 요소포접화합물의 분자군 형성을 위한 구조로 전환시켜주는 것이다. 이러한 과정은 Fig 5. 의 SEM 사진에서도 확인할 수 있다.

Conjugated Linoleic Acid의 합성 및 정제

Linoleic acid를 함유한 지방산이나 중성지질의 공역화는 AOAC 방법에 준하여 실시했다. 먼저 Ethylenglycol을 180℃로 승온 후 KOH을 서서히 주입하여 완전 용해시킨 후 지방산이나 중성지질을 주입하여 1시간 30분 염화 시킨다. 반응이 종결되면 상온까지 냉각한 후 메탄올을 넣고 진한 염산을 주입하여 pH 4로 적정하여 지방산으로 전환한다. 그 후 물과 헥산을 넣고 30분간 교반하며 상층부의 헥산층으로 지방산을 이동시킨다. 상층부의 지방산층은 회수하여 회전 진공 증발기로 헥산을 제거한다. 그 후 전환 후 발생된 부산물인 과산화물과 색소성분 등을 CLA: 활성백토 : 헥산을 혼합시킨 후 색소 성분을 제거한다. 이렇게 해서 얻어진 CLA의 Gas Chromatography의 결과는 Fig. 2 에 나타낸 바와 같이 cis-9, trans-11/ trans-9, cis-11 (47.3%), trans-10, cis-12/ cis-10, trans-12 (48.5%), cis-9, cis-11/ cis-10, cis-12 (1.7%), trans-9, trans-11/ trans-10, trans-12 (1.8%) 그리고 CLA unknown (0.7%) 이었다.

참고문헌

1. Pariza. M. W. and Hargraves. W. A., A beef derived mutagenesis         modulator inhabit initiation of mouse epidermal tumors by               7,12-dimethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 6, 591(1985)

2.  Haagsma, N., Van Gent, C. M., de Jong, R. W. and van Doorn,          E., JAOCS, 99,117 (1982)

3.  Bengen, F., German Patent Appl. oz 12438 (1940)

4. McAdie, H. G. and Frost, G. B., Can. J. Chem., 36, 635                   (1958)

Fig. 1 GC of Linoleic Acid 99

Fig 2. GC of CLA 99

Stepwise Addition

Non Stepwise Addition

Fig 3. DSC Patterns of Oleic acid UIC

Fig 4. XRD Patterns of Oleic acid UIC

Fig 5. Linoleic Acid UIC by Adding Method