다공성 실리콘 표면의 기능화를 통한 환경 독성물질 검출용

Theories and Applications of Chem. Eng., 2002, Vol. 8, No. 1

화학공학의 이론과 응용 제8권 제1호 2002년

biochip의 개발

김춘일, 임성혁, 이종민, 장선정

김문선, 김병우

성균관대학교 화학공학과

Development of a Biochip Using a Functionalized

Porous Silicon Surface to Detect Environmental Toxicants.

Chun-Il Kim, Sung-Hyuk Lim, Jong-Min Lee, Seon-Jung Jang

Moon-Sun Kim, and Byung-Woo Kim

Department of Chemical Engineering, Sungkyunkwan University

서론

산업 발전과 함께 면역기능을 약화시키고 imposex현상을 일으키는 내분비 교란물질들이 커다란 환경문제로 대두되었다(1, 2). 이에 따라 미량의 오염물질을 짧은 시간에 감지할 수 있는 센서의 개발이 필요하게 되었다. 현재 다공성 실리콘(PS)은 표면특성을 이용하여 enzymes 고정화, DNA fragments, antibodies 등에 사용되고 있으며 센서로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다(3).

본 실험에서 사용된 유전자 재조합 균주 E. coli ACV1003는 외부오염물질에 대한 DNA damage 발생시 대응효소로서 □-galactosidase를 분비하며, 이 □-galacto- sidase의 생성량을 분석함으로써 환경호르몬으로 널리 알려진 물질들을 정량적으로 검출할 수 있을 것으로 예상된다(5).

본 실험에서는 이러한 PS의 광학적 특성을 이용하여 내분비 교란물질을 검출하고 이를 기존의 생물학적 분석법과 비교 분석하였다.

이론

대부분의 bacteria들은 외부로부터의 열충격, DNA damage, 중금속 등의 충격이 가해져도 특정 유전자적 시스템에 의해 새로운 환경에 적응하며 살아갈 수 있도록 되어 있다. 특히 DNA damage가 있을 경우 SOS 레귤론 시스템이란 반응 시스템에 의해 복구되어 살아가게 된다. 생성된 □-galactosidase는 고전적인 enzyme assay 방식으로 정량할 수 있으나, 이를 위해 cell harvest 및 여러 단계의 추출 공정을 거치는 등 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 본 연구에서는 이와 같은 단점을 개선하기 위해 신속히 측정할 수 있는 광간섭 biosensor를 연구하고자 한다. 이 biosensor는 Si-wafer를 식각해 다공성(pore 크기: 25∼100nm)으로 만들고 다공성 표면에 부착되는 □-galactosidase의 농도에 따라 광간섭이 일어나는 현상을 이용한다(4, 6).

실험

1) 광간섭 biosensor용 porous silicon wafer 제조

실험에 사용된 p-type(boron-doped, 100) Si wafer는 식각에 앞서 ohmic contact 형성을 위해 wafer 뒷면에 aluminum을 피복시켰다. 만들어진 wafer는 teflon 재질의 식각기 내부에서 HF/ethanol 혼합용액으로 일정 시간동안 양극 식각하였다. 식각이 진행되는 동안 pore의 깊이를 고르게 하기 위해 UV light (254 nm)를 조사하였다.

□-galactosidase (Sigma Aldrich, Grade Ⅵ, 5,000 units)를 다양한 농도로 희석시킨 sample을 Si layer 표면에 30 분간 방치시킨 후 질소를 불어넣어 건조시켰으며 CCD detector (S2000, Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, U.S.A.)를 사용하여 광간섭 효과를 관찰했다. 각 sample의 측정이 끝나면 증류수와 ethanol을 사용하여 잔류효소를 최대한 제거했고 이러한 실험은 probe의 광원을 제외한 광침투를 방지하기 위하여 암상자에서  진행했다.

2) Porous silicon의 표면 기능화

(a) (2-pyridyldithiopropionamido propyl) trimethoxysilane의 제조

2,2-Bipyridyl disulfide와 3-mercaptopropionic acid를 혼합하여 12시간 반응시켰다. 이렇게 반응한 물질을 alumina column chromatography를 통하여 정제했다. 여기서 얻어진 혼합물에 EDC(1-(3-(Dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodiimidehydro-

chroride를 첨가하여 N2하에서 30 분간 교반한다. 여기에 3-aminopropyltrimethoxy

silane을 넣어 다시 12 시간 교반했다. 생성된 product는 silica chromatography를 통하여 다시 한번 정제했다(7).

(b) Porous layer의 기능화

위에서 합성된 (2-pyridyldithiopropionamido propyl)trimethoxysilane를 porous silicon wafer 표면에 고정화시키고 biotin-HPDP 첨가하여 porous layer를 기능화 시켰다(8).

결과

1) 광간섭 바이오센서에 이용할 porous Si wafer를 위의 실험 조건에서 etching한 결과 실험에 적합한 pore size를 조절할 수 있음을 알 수 있다. (Fig. 1).

2) Porous silicon의 표면기능화를 위해 (2-pyridyldithiopropionamidopropyl)trimeth-

oxysilane를 제조하고 이를 NMR을 통하여 확인하였다.

3) 저농도 □-galactosidase activity의 검출을 위해서는 광간섭을 이용한 biosensing method를 이용하였다. □-galactosidase의 농도에 따라 effective optical thickness의 변화량은 sigmoid type으로 증가했다

Fig. 1. SEM microscope of a porous silicon surface etched by HF:ethanol solution

Fig. 2. NMR spectrometric analysis of a functionalized group with (2-pyridyldithiopropionamido propyl)trimethoxysilane

참고문헌

1. Bryan, G. W. and Gibbs, P. E.: "Impact of low concentrations of tributyltin    on marine organisms, In: Newman MC, McIntosh AW eds. Metal             Ecotoxicology: Concepts and Applications". Lewis Pub. Inc, Michigan, USA    (1991).

2. Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., and Sumpter, J. P.: Environ.   Sci. Tech

nol., 32, 2498(1998).

3. Vollmer, A. C., Belkin, S., Smulski, D R., Van-Dyk, T. K., and LaRossa, R.    A.: Appl. Environ. Microbiol., 63, 2566(1997).

4. H□rion, R:. Properties of porous silicon; Datareview Ser. No. 18; Canham:       London,  89-96 (1997).

5. US EPA, 40 CFR(Code of Federal Regulation) Part 180. Environmental         Protection Agency, U. S. A (1996).

6.  Andrease, J. and Keiki-pua, S. D:, J. Am. Chm. Soc., 120, 12108(1998).

7. Miller, J. H.: Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Labo-    ratory. Cold Spring Harbor, N. Y. (1972).

8. Koyano, T. and Saito, M.: Biotechnol. Prog. 12, 141(1996).