D(-)-□-hydroxyisobutyric acid의 생산

백 승우, 김 남기, 성 동호*, 백 우현*

성균관대학교 화학공학과, 보령제약(주) 종합연구소*

Production of D(-)-□-hydroxyisobutyric acid

S.W. Baek, N.K. Kim, D.H. Seong*, W.H. Paik*

Department of Chemical Engineering Sung Kyun Kwan University

* Boryung Central Research Institute

서 론

고혈압치료제인 Captopril (N-(3-mercapto-2-D-methylpropanoyl)-L-proline)은 세계시장에서 약 11억 달러의 판매량을 보이는 대표적인 chiral drug이다.1,2 미국의 Squibb사가 세계최초로 Captopril을 생산하였으며, 국내에서는 보령제약에서 화학적인 합성방법으로 생산하고 있다.

화학적인 합성에 의한 chiral drug은 racemic mixture의 resolution process가 필요하다. 이러한 공정으로 인해 수율이 50%이하로 되는 단점이 있다3,4. 그러나 광학활성물질을 원료물질로 사용할 경우, resolution process가 필요하지 않으며, 높은 수율을 얻을 수 있다.

광학활성 원료물질인 D(-)-□-hydroxyisobutyric acid (D-HIBA)은 captopril의 합성에 이용되고 있다5. 일반적으로 D-HIBA은 formaldehyde와 ethyl □-bromopropionate로부터 화학적 합성방법에 의해 생산하는 방법이 알려져 있으나, 이렇게 얻은 HIBA는 racemate형으로 분리공정이 복잡하여 경제적으로 아주 불리하다. 그러나 미생물을 이용하여 isobutyric acid (IBA)나 methacrylic acid (MA)를 기질로 한 D-HIBA 생산은 분리공정이 필요하지 않으며, 높은 수율을 얻을 수 있다. 미생물을 이용하여 HIBA를 생산하기 위한 연구는 Goodhue (1971) 등의6 Pseudomonas putida를 이용한 IBA로부터 L(／)-HIBA의 생산 연구를 시작으로 하여 Aberhart (1977) 등은7 입체 화학적인 관점에서 IBA 및 MA로부터 L(／)-HIBA의 생산에 관한 연구를 수행하였고, Ohta (1979) 등은8 Gluconobacter roseus를 사용하여 2-methyl-1,3- propanediol로부터 수율 47%의 D-HIBA의 생산을 보고한 바 있으나 산업화하기에는 미흡하였다. 1980년대 초 일본 Kanegafuchi사는9,10 Candida rugosa을 사용하여 IBA로부터 고순도의 D-HIBA를 제조하는 방법을 개발하여 산업화하였으며, Squibb사에 독점 공급하는 것으로 알려지고 있다.

최근에, 보령제약종합연구소에서는 Candida rugosa IFO 0750를 UV변이조작시켜 D-HIBA의 분해능이 결여된 Candida rugosa BR-120 변이균주를 얻었다.

본 연구에서는 Candida rugosa BR-120을 이용한 fed-batch fermentation을 통해 90%이상의 전환수율과 고농도의 D-HIBA를 얻고자 한다.

실 험

1. 균주

본 연구에서는 D-HIBA를 생산하는 것으로 알려진 Candida rugosa  KCCM 35430 (=IFO 0750)을 UV변이조작하여 얻은 Candida rugosa BR-120 균주를 이용하여 연구를 진행하였다.

2. 배지 및 시약

균주보존을 위한 배지로는 YM agar (Table 1.)를 사용하였으며, 종배양배지로는 YM broth (Table 1.)를 사용하였다. 분석을 위하여 사용한 시약은 시약 1급을 사용하였으며, 발효조에서 사용한 GⅠ배지와 feed배지는 Table 2.와 같다.

Table 1. Composition of YM agar and broth

Component	Concentration ( g/L )
	YM agar	YM broth
Distilled Water Yeast extract Malt extract Peptone Dextrose Agar pH after autoclaving	1000 mL 3 3 5 10 20 7.2	1000 mL 3 3 5 10 - 7.2

Table 2. Composition of fermentation medium for D-HIBA production

Component	Concentration ( g/L )
	GⅠ medium	feed medium
Distilled Water Glucose (NH4)2HPO4 KH2PO4 Yeast extract NaCl MgSO4·7H2O ZnSO4·7H2O FeSO4·7H2O CuSO4·5H2O MnSO4·4H2O	1000 mL 40 13 7 3 0.1 0.8 0.06 0.09 0.05 0.01	1000 mL 300 5 2.7 1.2 0.04 0.3 0.02 0.03 0.02 0.004

3. 배양방법

1) Seed 배양

YM agar slant에 보존 중인 Candida rugosa BR-120을 1 loop 떠서 10mL의 YM broth medium을 포함하는 250mL 삼각플라스크에 접종한 후 30℃, 350rpm으로 1일간 회전진탕배양하였다. 5mL 배양액을 1.5% IBA가 함유된 50mL의 GⅠ medium을 포함하는 1L 삼각플라스크에 접종한 후 30℃, 350rpm으로 3일간 회전진탕배양하였다.

2) Fed-batch fermentation

1.5% IBA를 함유한 생산배지 3L에 450mL Seed를 접종하였다. 이때 5L Jar fermentor(Korea Fermentor Co., LTD.)가 사용되었다. pH는 7.0-7.2이 유지되도록 10N NaOH와 10N KOH를 1:1로 혼합하여 공급하였다. Fed-batch fermentation중에는 기질인 IBA와 Glucose를 0.5-1.5%가 되도록 연속적으로 공급하였다. 또한 통기량과 교반속도는 1.5-2.0 vvm과 500-1000 rpm으로 조절하였고 온도는 30℃로 유지시켰다.

4. 분석방법

1) TLC 분석

Thin layer chromatography (TLC)에 사용한 plate는 Kieselgel 60. F254. Merck제이다. 이동상은 ethyl acetate : propyl alcohol : H2O = 10 : 2 : 1를 사용하였고, 발색제는 0.1% 2,6-dichlorophenolindophenol-methanol을 사용하였다. 원심 분리시킨 배양액을 2N-H2SO4로 산성화하여 TLC판 위에 점적시켰다.

2) Gas Chromatograph

분석기기로는 PERKIN-ELMER SIGMA 3B gas chromatograph를 사용하였다. 고정상으로는 FAL-M 12% shimalite(AW-DMCS), 80-100 mesh이고, □2□ × 180□ glass, packed column을 사용하였다. 이동상은 N2 50 mL/min으로 하고, 검출은 FID detector로 하였다.

3) HPLC

Waters 510 HPLC pump, 484 Tunable Absorbance Detector MILLIPORE를 이용하여 분석하였다. 칼럼은 BONDAPAK C18 125Å (10□) □3.9□ × 300□를 사용하였다. 이동상은 pH 2.4로 조정한 0.005M (NH4)H2PO4를 사용하였다.

4) Cell mass

Cell growth는 600nm에서 증류수로 50배 희석하여 Shimadzu사의 UV-160A UV-visible recording spectrophotometer를 사용하여 optical density를 구하였다.

5) Glucose concentration

Glucose 농도는 DNS반응을 이용하여 측정하였다.

결론 및 토의

Candida rugosa IFO 0750를 UV변이조작하여 얻은 Candida rugosa BR-120은 D-HIBA 분해능이 결여되어있다. 이러한 Candida rugosa BR-120을 이용하여IBA를 기질로한 144시간 fed-batch fermentation에서 100.76 g/L의 D-HIBA를 생산하였으며, 이때 전환수율은 99.86%이었다.

참고문헌

(1) Ondetti, M. A., Rubin, B. and Cushman, D. W. : Science, 196, 441-444,

(1977).

(2) Copyright Pmsi International : 1995 Pharmaceutical global review,

Leading Pharmaceutical Products, 1989-1994, (1996).

(3) Sheldon, R. A., Porskamp, P. A. and Hoeve, T. : Biocatalysts in organic

syntheses, 59-80, (1985).

(4) Bayley, C. R. and Vaidya, N. A. : Chirality in industry, 69-77, (1992).

(5) Shimazaki, M. : Chem. pharm. Bull., 30(9), 3139-3146, (1982).

(6) Goodhue, C. T., Schaeffer, J. R. : Biotechnol. Bioeng., 13, 203, (1971).

(7) Aberhart, D. J. : Bioorg. Chem., 6, 191, (1977).

(8) Ohta, H. and Tetsukawa, H. : Chem. Lett., 1379, (1979).

(9) Hasegawa, J. : J. Ferment. Technol., 59(3), 203-208, (1981).

(10) Hasegawa, J. : J. Ferment. Technol., 60(6), 501-508, (1982).

감 사

본 연구는 과학기술처에서 시행한 특정연구개발사업의 지원에 의하여 수행되었습니다.