역상 고성능 액체크로마토그래피에서 뉴클레오타이드의 흡착특성

이 주 원, 노 경 호, 최 대 기*

인하대학교 화학공학과, 한국과학기술연구원 CFC대체기술센터*

Adsorption Characteristics of Nucleotides in RP-HPLC

Ju Weon Lee, Kyung Ho Row, Dai Ki Choi

Dept. of Chem. Eng., Inha Univ., CFC Alternatives Technology Center*

서 론

뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드, 인산기 및 염기성 물질로 구성되어 있으며 미생물 효소 등에 의해서 분해된다. 분해물은 대개 저 농도에서 다성분계로 존재하고 있으며 다양한 정제방법을 거쳐서 산업적으로 이용된다. 이 중에서 5'-IMP, 5'-GMP등은 향미촉진제, 이노신, ATP, cAMP등은 신장병 및 고혈압의 치료제로서 이용되고 있다. Purine 또는 pyrimidine compounds의 분리에는 주로 anion-exchange chromatography가 이용되지만 최근에는 역상에서 이러한 물질을 분리한 연구결과가 발표되었다 [1].

본 고에서는 5□-GMP의 뉴클레오타이드에 대한 C18 packing에서의 흡착특성을 규명하기 위해서 흡착평형 data로 부터 평형식을 구하였다. 시료의 양이 많아지게 되면 고정상과 이동상의 평형농도는 비선형 관계가 되며 peak의 형태는 비대칭이 되며 전체 체류부피는 작은 양에 비해서 크게 늘어나게 된다. 따라서 제조용 규모로 분리하게 되는 경우, 흡착선형식은 분리된 물질의 순도와 생산량에 영향을 미치게 된다. 기존의 static method와 비교해서 Frontal analysis는 chromatographic column에서 쉽게 구할 수 있는 장점이 있다 [2]. 사용한 이동상은 순수한 물을 사용하여 각 물질에 대한 흡착평형 data를 얻었다. 본 연구에서는 Frontal analysis에 의하여 비선형 흡착평형식을 구하고 단이론 (plate theory)을 사용하여 시료의 주입 양에 따른 peak shape의 변화를 고찰하는 것이 목적이다.

이 론

단이론에 의해서 흡착제가 채워진 크로마토그래피용 column은 N개의 부분으로 나뉘어진 평형단으로 구성되어 있다고 가정할 수 있다. 각 단에서는 이동상과 고정상 사이에 용질이 흡착 평형을 이루며 이동상의 이동방향으로 이동한다. Column의 이론 단수 N은 다음 식으로 구할 수 있다.

[eqn: N=16 LEFT ( t_R over w RIGHT ) ^2]	(1)

여기서 tR은 용질의 체류부피이고 w는 peak의 넓이이다. 임의의 n단에서의 물질 수지식은 다음과 같다.

[eqn: c_n-1 dv-c_n dv=v_m dc_n +v_s dc_s]	(2)

ci는 i단에서의 이동상에 용해되어 있는 용질의 농도이고 cs는 고정상에 흡착된 용질의 농도이다. vm과 vs는 한 단에서 이동상과 고정상의 부피이다. v는 단을 통과한 이동상의 부피로 일정한 유속에서는 시간으로 바뀔 수 있다.

Frontal analysis에 의해서 일정한 농도의 용액을 column내로 통과시켜 steady state가 되면 용질이 고정상과 이동상 사이에 흡착 평형을 이루게 된다. Column의 물질 수지식은 다음과 같이 세울 수 있다.

[eqn: m_"in" - m_out = m_acc]	(3)

macc는 column내에 있는 용질의 양이고 min과 mout은 column에 주입된 용질의 양과 나온 용질의 양으로 다음과 같다.

[eqn: m_"in" = INT _{ 0}^{ t} c_0 v(t) dt]	(4)

[eqn: m_out = INT _{ 0}^{ t} c_eff (t) v(t) dt]	(5)

c0는 column에 주입되는 용질의 농도이고 ceff(t)는 column의 출구에서의 용질의 농도이다. 그리고 v(t)는 column을 통과하는 이동상의 유속이다. 그러므로 macc에서 column내에서의 이동상에 있는 용질의 양을 빼면 고정상에 흡착된 용질의 양을 알 수 있다.

[eqn: m_ads = m_acc - c_0 V epsilon]	(6)

V는 column의 전체 부피이고 □은 column내의 이동상의 부피비이다.

흡착평형식은 Ferundlich isotherm을 사용하였으며 다음과 같다.

[eqn: C_S = AC_M `^b]	(7)

CS와 CM은 column내의 고정상과 이동상에서의 용질의 농도이고 A와 b는 상수이다. 평형상수 (K)는 정의에 의해서 다음과 같이 나타낼 수 있다.

[eqn: K= C_S over C_M]	(8)

실 험

HPLC system는 Waters사에서 나온 600E Multisolvent Delivery System, U6K injector (2ml sample loop), 486 UV tunable detector를 사용하였고 data acquisition system은 CHROMATE (ver. 3, Interface Eng.) 3.9mm×300mm의 column에 Lichrospher 100 RP-18 (15□m, Merck) 2.10g을 충진하여 사용하였다. 실험에 사용된 뉴클레오타이드 5□-GMP (Guanosine 5'-monophosphate Disodium salt)는 Fluka에서 구입하였고 18M□/m로 deionized된 물에 녹여 4000ppm의 저장용액을 만들어서 10ppm, 50ppm, 100ppm, 500ppm, 1000ppm, 2000ppm으로 각각 희석하여 사용하였다. 이동상으로 쓰인 물은 증류수를 18M□/m로 deionized하여 0.45□m filter로 감압 filtration하여 사용하였다. 실험 중 이동상은 헬륨을 100ml/min의 유속으로 이동상내에 통과시켜 탈기하였다. 모든 실험은 상온에서 행하여 졌다. 이동상의 유속은 1ml/min, detector의 wavelength는 300nm로 고정하였다.

결과 및 고찰

5□-GMP의 흡착평형 data는 Table 1.에 나타나 있다. 평형상수가 0.12에서 0.33으로 매우 작음을 알 수 있는데 이는 5□-GMP가 salt의 형태로 있기 때문에 물에 용해되면서 이온화되어 극성을 가지게 된다. 그러므로 비극성의 고정상과 흡착이 잘 이루어지지 않기 때문에 평형상수 가 작게 나온 것으로 보인다.

Table 1. Adsorption equilibrium data and equilibrium constants

CM (□g/ml)	CS (□g/ml)	K
50	6.11	0.12
500	79.09	0.16
1000	222.88	0.22
2000	661.35	0.33

Fig. 2.은 흡착평형 data를 Freundlich isotherm에 fitting한 그림으로 A는 0.0048, b는 1.56이고 regression coefficient (r2)는 0.9998로 잘 일치하고 있다. b값이 1보다 크기 때문에 높은 농도에서는 CM의 증가량보다 CS의 증가량이 더 커지게 된고 높은 농도에서는 평형상수가 낮은 농도의 평형상수보다 더 커지는 경향을 보이게 된다.

Fig. 2. Adsorption isotherm of 5'-GMP on C18 packing

Fig. 1. Breakthrough curve for adsorption of 5'-GMP

농도가 증가하면서 평형상수가 증가하는 경향을 보여주고 있다. 평형상수와 용량인자는 서로 선형적인 관계가 있기 때문에 평형상수가 증가하게 되면 용량인자도 증가하게 된다. 그러므로 평형상수가 증가하게되면 체류시간이 늘어나게 된다. 그러므로 pulse injection의 경우 column에 들어가는 용질의 양이 많아지는 만큼 용질의 체류시간은 늘어나게 된다. Fig. 3.은 용질의 양에 따른 chromatogram으로 용질의 양이 늘어날수록 체류시간이 늘어나고 있는 것을 보여주고 있다.

Fig. 3. Chromatogram of 5'-GMP

(sample concentration : 1000ppm, wavelength : 280nm, flow rate : 1.0ml/min)

참고 문헌

1.  J. Zhan, R. Todd, and G.H.. Float., J. Chromatogr., 673, 167, 1994.

2.  A. Akgerman and M. Zardkoohi, J. Chem. Eng. Data, 41, 185, 1996.

알 림

본 연구는 과학재단 핵심전문연구 (과제번호:971-1107-048-2)의 지원에 의한 연구 결과입니다.