하이브리도마 배양액의 아미노산과 노폐물의 조성 변화

현병용, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Analysis of the Amino Acids and Wastes in the Hybridoma Culture Broth

Byoung-yong Hyun, Hongwoo Park

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

서  론

하이브리도마 세포의 배양은 단세포군항체(Monoclonal antibody) 등의 산물을 생산하는데 이용하는 기술이다.  하이브리도마 세포 배양의 산업적 이용을 위해서는 생산성 향상이 중요한데 이를 위해 배지의 최적화에 관한 많은 연구가 행해지고 있다.  하이브리도마 세포의 일반적 회분식 배양에서 1∼2×106 cells/mL 밖에 성장하지 않는데 이는 성장인자나 영양원의 고갈, NH4+, lactate 등 노폐물의 축적, pH의 저하, 산소공급의 한계 등에 의한 것으로 알려져 있다.  배지에 포함되어 있는 포도당과 glutamine은 에너지원으로 사용되면서 세포의 성장에 필요한 핵산, 비필수 아미노산 등의 합성에 관여할 뿐 아니라 세포의 성장을 저해하는 것으로 알려진 lactate와 NH4+가 대부분 포도당과 glutmaine으로부터 생성되기 때문에 두 물질에 관한 연구가 특히 많이 이루어지고 있다.

포도당과 glutamine의 농도를 낮게 유지시켜주는 연구로 포도당 0.2g/L, glutamine 0.1g/L 이하로 유지시켜 주는 배지첨가식 배양 방법이 있었는데 그 결과 4.1×106 cells/mL의 세포농도와 172 mg/L의 항체농도를 얻을 수 있었다.  RPMI-1640 배지를 이용한 실험에서 아미노산과 비타민의 농도를 5, 10, 20배 강화한 배지를 이용하여 배양한 결과 세포주에 따라서 0.4∼1.3×107 cells/mL의 높은 세포농도를 얻을 수 있었다.  양론적인 모델식을 이용하여 새로운 배지를 개발하려는 연구도 시도되었으며 그 결과 일반적인 회분식 배양에서보다 5배 정도 높은 세포농도와 10배 정도 높은 항체농도를 얻을 수 있었다.  그러나 이러한 배지 개선 방법들은 배지의 효율성이 떨어지거나 계산과정이 복잡할 뿐만아니라  노폐물을 제거하는 장치를 추가로 설치할 경우 배양기가 전체적으로 너무 복잡하게 된다.

본 연구에서는 기초배양을 통해 부족한 영양원과 각각의 영양원에 대한 수율을 계산하여 이를 토대로 목적하는 세포농도에 적합한 양의 영양원을 첨가하여 배양함으로써 하이브리도마 세포의 성장을 제고하고자 한다.  기초실험으로 5F12 AD3 하이브리도마 세포와 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 사용하여 T-flask, spinner flask, 배양기를 이용한 회분식 배양을 행하여 각 배양법에 따른 세포의 성장을 비교하였다.  또 포도당과 glutamine 등 몇몇 아미노산을 보강한 배지를 이용하여 pH를 조절하여 주면서 배양을 행하여 높은 세포농도를 얻고자 하였다.

재료 및 실험 방법

세포주 및 배지

배양에 사용된 세포는 5F12 AD3 하이브리도마(ATCC HB 8209) 세포이다.  이 하이브리도마 세포는 EPO(Erythropoietin)와 반응하는 mouse monoclonal antibody(IgG1)을 분비하는 세포로서 EPO에 의해 면역된 BALB/C mice 유래의 spleen cell과 SP2/0-Ag14 myeloma cell을 융합시켜 얻어진 세포이다.  배지는 5%의 FBS(Fetal Bovine Serum)를 포함하는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 배지를 이용하였다.  배지 제작 시에는 초순수를 사용하였으며 3.024g/L의 sodium bicarbonate와 50□g/L의 젠타마이신(gentamycin), FBS를 배지에 첨가한 후 0.22□m의 여과막을 이용하여 준비하였다.  부족 영양원을 첨가하여 배양한 실험에서는 비교적 많이 감소한 7개의 아미노산을 IMDM 배지에 들어있는 양의 2배만큼 추가로 첨가한 배지와 거기에 IMDM 배지에 들어있는 양만큼의 포도당을 첨가한 배지에서 배양이 행해졌다.

배양 방법 및 배양 조건

배양은 T-flask, spinner flask와 자체 제작한 2L 배양기를 이용하여 행해졌다.  T-flask 배양과 spinner flask 배양은 37℃의 CO2 배양기에서 이루어졌으며 CO2의 농도는 5%로 고정하였으며 spinner flask 배양의 경우 40rpm으로 교반하여 주었다.  배양기를 이용한 회분식 배양에서는 온도 37℃, DO 40% air saturation으로 맞추어 주었으며 75rpm으로 교반하여 주었다.  초기 세포농도는 2.0×105 cells/mL로 맞추어 주었으며 8시간마다 시료를 취하여 세포농도와 세포의 활성, pH를 측정하였고  16시간 간격으로 아미노산 분석으로 행하였다.  세포농도는 hemocytometer를 이용하여 측정하였으며 세포활성은 trypan blue exclusion 방법을 이용하였다.

분  석

분석은 아미노산, 포도당, lactate, NH4+에 대하여 행하였다.  아미노산 분석은 HPLC를 이용하여 Pico-tag 방법으로 행하였는데 phenylisothiocyanate를 이용하여 유도체화시킨 후 Pico-tag column과 254nm의 UV 검출기를 이용하여 분석하였다.  용매는 초순수에 sodium acetate, acetonitrile, EDTA를 첨가한 A용매와 acetonitrile, 초순수, 메탄올을 혼합한 B용매를 이용하였다.  포도당와 lactate의 분석은 Aminex HPX-87H column을 장착한 HPLC를 이용하여 굴절율 검출기로 분석하였다.  용출액으로 0.01N H2SO4 용액을 사용하였다.  NH4+는 IonPac CS12A analytical column과 IonPac CS12A guard column이 장착된 IC(Ion Chromatography)를 이용하여 분석하였다.

결과 및 고찰

배양방법에 다른 세포성장 비교

세 가지 배양방법을 이용한 하이브리도마 세포의 회분식 배양에서 spinner flask와 배양기에서는 비슷한 세포성장과 아미노산의 대사를 관찰할 수 있었으나 T-flask 배양의 경우 세포는 spinner flask, 배양기를 이용한 배양에 비하여 상당히 낮은 농도까지 밖에 성장하지 않았다.  각각의 배양 방법에 따른 세포농도와 pH의 변화를 Figure 1에 나타내었다.  최대 산세포농도는 T-flask 배양 1.07×106 cells/mL, spinner flask 배양 1.69×106 cells/mL, 배양기를 이용한 배양 1.75×106 cells/mL이었다.  배양시간에 따른 pH의 변화는 각각의 배양에서 비슷한 경향을 보였다.

Spinner flask 배양과 배양기를 이용한 배양에서 초기농도를 1로 하였을 때 아미노산의 조성변화를 Fig 2, Fig 3에 나타내었다.  그림에 나타나 있듯이 spinner flask 배양과 배양기를 이용한 배양에서 배양 말기에 glutamine이 거의 고갈되거나 완전히 고갈되었고, 다른 아미노산들은 초기농도의 약 30∼50%까지 감소하였다.  Alanine은 초기 농도의 4배까지 증가하였다가 glutamine이 완전히 소비된 이후에는 감소하여 spinner flask 배양에서와 비슷한 양상을 보였다.  실험 결과로부터 T-flask, spinner flask, 배양기를 이용한 회분식 배양에서 배양 말기에 세포의 성장이 둔화되는 것은 T-flask 배양의 경우 pH의 저하와 산소의 공급이 원활하지 못하기 때문이고 spinner flask 배양, 배양기를 이용한 회분식 배양에서는 pH의 감소와 아미노산, 특히 주에너지원으로 사용되는 glutamine의 고갈에 의한 것임을 알 수 있다.

Spinner flask 배양, 배양기를 이용한 회분식 배양에서 아미노산에 대한 세포의 수율을 Table 1에 나타내었다.  수율은 세포가 활발하게 성장하는 구간인 배양 시작 후 0시간과 48시간에서의 세포농도 및 아미노산 농도 자료를 이용하여 계산하였다.  Spinner flask 배양과 배양기를 이용한 회분식 배양에서 glutamine에 대한 세포의 수율은 각각 0.0293×108 cells/mg, 0.0272×108 cells/mg으로 아주 비슷한 값을 나타내며, 나머지 다른 아미노산에 대해서도 두 배양 방법의 수율이 같음을 보인다.  본 실험은 spinner flask를 이용한 배양중 활발한 성장구간에서의 대사자료가 큰 규모의 배양을 위한 기초자료로 이용될 수 있음을 뜻한다.

부족 영양원을 보강한 배지에서의 배양

기초실험으로부터 얻어진 결과를 토대로 비교적 많이 감소한 아미노산을 첨가하여 하이브리도마 세포의 성장을 제고하고자 하였다.  7개의 아미노산을 IMDM 배지에 포함된 양의 2배만큼 첨가한 배지를 이용한 배양에서 1.93×106 cells/mL의 최대 산세포농도를 얻을 수 있었다.  배양시간에 따른 세포농도의 변화와 pH의 변화를 Figure 4에 나타내었다.  세포농도의 경우 배양시작후 72시간에서 최대 산세포농도를 보였으며 이후 세포활성의 급격한 감소가 나타났다.  배양액 중의 아미노산 조성을 분석한 결과 glutamine을 포함한 아미노산은 배양말기까지 잔존하는 것으로 나타났다.  배양시간에 따른 lactate, 포도당, NH4+의 농도 변화를 Fig 5에 나타내었는데 그림에서 보듯이 포도당은 배양말기에 완전히 고갈되는 것으로 관찰되었다.  분석 결과로부터 배양말기에 세포의 성장이 둔화되고 활성이 급격하게 감소하는 것은 아미노산의 고갈에 의한 것이 아니라 포도당의 고갈에 의한 것임을 알 수 있다.

본 연구에서는 우선 배양액의 성분 중 아미노산, 포도당, lactate, NH4+를 체계적으로 분석할 수 있는 방법을 제시하였고 이를 통해 동물세포의 회분식 배양에서 배양 방법에 따른 세포의 대사에 대하여 조사하였다.  또 기초실험을 통해 부족하다고 판단되는 영양원을 보충하여 배양에 이용함으로써 원래의 배지를 이용하였을 때보다 더 높은 농도로 세포가 성장함을 관찰할 수 있었다.  실험을 통해 아미노산을 보충하여 준 배지에서 포도당의 고갈에 의해 세포의 성장이 중단됨을 관찰하였는데 이에 관한 체계적인 연구가 필요하겠다.

참고문헌

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Table 1.  Cell yield on amino acid in spinner

flask and batch cultrue(×108 cells/mg)

Amino acid	Spinner flask culture	Batch culture
Glutamine	0.0293	0.0272
Methionine	0.827	0.841
Isoleucine	0.227	0.228
Leucine	0.224	0.216
Arginine	0.280	0.300
Valine	0.307	0.285
Aspartate	1.503	1.270

Fig 1.  Cell density and pH variation in

T-flask, spinner flask, batch culture

Fig 2.  Amino acid variation in spinner         Fig 3.  Amino acid variation in batch

flask culture                                   culture

Fig 4. Cell density and pH variation in       Fig 5.  Glucose, lactate and ammonium conc.

amino acids supplementation exp.              in amino acids supplementation exp.