HCl 가수분해가 GOD고정화  합성이분자막의 효소 활성에 미치는 영향

김정란(학), 변인섭(학), 김운수(학), 김우식(정), 김용욱(정)

경희대학교 화학공학과

A study of effect on enzymatic activity of GOD immobilized

synthetic bilayer membrane of HCl hydrolysis

Jung-Ran Kim, In-Seop Byun, Woon-Soo Kim, Woo-Sik Kim and Yong-Wook Kim

Dept. of Chem Eng., Kyung Hee University

서론

최근 생명과학(life science)의  발달과 더불어 산업 및 인간 복지생활에 많은 변화를 가져왔다. 그 하나의 예가 생화학 반응에 이용되는 생체촉매로서 효소이다. 효소는 단백질의 일종으로, 동물, 식물, 미생물등의 생세포에서 생성되는데 생화학 반응의 촉매역할을 한다. 그러나 효소반응 자체가 수용액 상태에서 진행되기 때문에 반응완료후 생성물과 효소의 분리가 곤란하여 효소를 재 사용할 수 없다는 단점을 가지고 있다.(1)

본 연구에서는 담체로서 나일론 캡슐막을 제조하고 HCl로 가수분해하여 아미노기를 활성화시킨 뒤 glutardehyde를 이용하여 glucose oxidase(GOD, E.C.1.1.3.4)와 공유결합 하였다.(2) 그리고 여기에 합성 이분자막을 이루는 양쪽친매성 물질을 피복시켜서 GOD가 고정화된 합성 이분자막을 제조하였으며 나일론 캡슐막을 HCl로 가수분해할 때 HCl의 농도, 온도 및 시간의 변화에 따라 효소반응에 미치는 영향에 관하여 고정화 효소의 활성을 측정하고 가수분해에 따른 최적조건을 도출하고자 하였다.

이 론

효소를 불용성 담체에 결합시켜 불용화 하는 방법인 담체가교법으로 의한 방법으로 나일론 캡슐막을 제조하여 GOD를 고정화시키고 합성이분자막을 이루는 물질로 피복시킨 것을 도식적으로 나타내면 Fig.1과 같다.

GOD고정화 담체로 쓰인 비대칭구조를 이루며, 반투과성막으로 물리적으로 강한 나일론 캡슐막은 계면중합(interfacial polymerization)에 의해 얻어진다.(3) 계면중합법은 유기용매에 이 염기산 chloride인 terephthaloyl chloride를 녹인 용액에 알칼리성 수용액 ethylenediamine을 용해 시켜 유기상으로 적하하면 순간적으로 두 용액의 계면에서 poly(ethylenterephalamide)캡슐막이 생성된다. 이것을 반응식으로 나타내면 (1)과 같다.

-HCl

H2N(CH2)2NH2 + ClCOC6H4COCl ―→ -[-NH(CH2)2NHCOC6H4CO-]-  (1)            base

Fig.1. Schematic illustrations of GOD-immobilized nylon capsule

이렇게 얻어진 나일론 캡슐막은 공유결합에 의한 효소 고정화 과정에서 나일론 캡슐막의 결합능력을 높이기 위해 HCl로 가수분해한다. 나일론 캡슐막이  HCl로 가수분해되어 반응식 (2)와 같이 공유결합하기 위한 작용기가 도입되어  활성화가 된다.

(2)

HCl에 의해 활성화된 나일론 캡슐막은 glutardehyde와 반응하여 공유결합하게 되고 여기에 GOD를 고정화하게 되는데, 그 반응을 구조식으로 나타내면 (3)과 같다.

(3)

실 험

본 연구에서는 먼저 계면중합법으로 나일론 캡슐막을 제조하여 HCl로 가수분해한 후 glutardehyde로 처리하고 GOD를 고정화 시켜 합성 이분자막을 제조하였다. 고정화 효소의 활성 측정은 GOD가 glucose와 물에서 산소와 반응하였을때 생성되는 gluconic acid를 pH전극으로 측정하였다.(4) 그리고 GOD고정화 합성이분자막 다공질 표면구조를 알아보기 위해 캡슐은 건조후  S.E.M.(STEREOSCAN 440, Leica, England)을 이용하여 표면을 고정화 단계에 따라 관찰하였으며, particle size는  JVC社의 color video carmer TK-1070U를 사용하여 촬영하였으며 크기는 pentium pc로 control하며 Image Analyzer로 측정하여 diameter를 측정하였다.

결과 및 토론

1. 효소 고정화 담체로서 나일론 캡슐막의 특성

본 연구에서 GOD고정화 담체로 이용된 나일론 캡슐막은 Okahata(5)등의 제조 방법을 기초로하여 제조하였다. 반응조건으로 알칼리성 수용액 0.38M ethylenediamine과 terethaloyl chloride 1mmol을 벽재물질로 하였으며 유기용매로는 chloroform과 cyclohexane 부피비가 3:1인 혼합용액에 가교제로 trimesoyl chloride 3mol%를 넣고 pH가 12인 캡슐막을 제조하였다. 이렇게 제조된 캡슐막의 특성을 다음 Table 1에 나타내었다.

Table 1. Physical Properties of GOD-immobilized nylon capsule

	nylon capsule	bilayer-corked capsule
diameter (□)	2.7 □ 0.1
thickness (□)	14 □ 0.2
weight (□)	0.003	0.025 (containing liquid phase)
amounts of a immobilzed GOD (□)	0.001

제조된 나일론 캡슐막의 모양은 거의 구형을 나타냈으며, size는 일정한 크기로 제조되었다. 나일론 캡슐막의 비대칭 다공질 구조가 HCl로 가수분해하게 되면 어떤한 현상을 나타는지를 관찰하기 위해 캡슐 건조후  S.E.M.을 이용하여 표면구조를 관찰하였으며 그중 HCl로 가수분해된 나일론 캡슐막을 Fig. 2에  나타내었다.

Fig. 2. Scanning electron microscope of surface of nylon capsule membranes

SEM의 결과를 보면 나일론 캡슐막의 표면은 비대칭 다공질 구조를 보이며 HCl로 나일론 캡슐막을 가수분해 하였을 경우 세공이 거의 보이지 않으며 평편한 모양이 나타났다. 이와 같은 원인은 나일론 캡슐막을 HCl로 가수분해 함으로써 고분자의 구조가 변화하여 매끄럽게 보이는 것으로 추측된다.

참고문헌

1. K. Takemoto, Y. Iinki, & R. M. Otten brite: "Functional monomers and polymers□, MARCEL DEKKER, 461(1987)

2. S.Vishwanath, D. Bhattacharyya, W. Huang, L.G. Bachas: J. Membrane Sci, 108, 1(1995)

3. Julio Baba, A. Mottola: Critical Reviews in Analytical chemisty, 25(1), 1(1995)

4. Clarence H. Suelter, Larry Kricka: Methods of biochemical analysis, 36, 61 (1992)

5. Y. Okahata, Han-Jin Lim, S. Hachiya, gen-Ichi Nakamura: J. Polymer Sci, 19, 237(1984)