Methylococcus에 의한 propylene으로부터 propylene oxide 생성

강환구, 전희진, 이문원

한남대학교 화학공학과

The propylene oxide production from propylene by Methylococcus

Whankoo Kang, Heejin Chun, Moonwon Lee

Dept. of Chem. Eng., Hannam Univ.

서론

Epoxide는 Epoxy homopolymer와 copolymer를 형성하는 매우 중요한 화학물질이며 이들중 ethylene oxide와 propylene oxide가 가장 중요한 상업화된 epoxide이다. 현재 propylene oxide의 90% 이상이 chlorohydrin이나 또는 oxirane process에 의해 생산되어지고 있는데 이들 process는 많은 단계가 필요하고 styrene과 같은 부산물의 시장가격에 의해 경제성이 크게 좌우되는 process이다. 그래서 propylene oxide는 대량으로 가장 많이 쓰이는 50가지 유기화학 물질중 3번째로 가격이 높은 물질이다. 그러므로 미생물을 이용한 propylene oxide로의 경제적인 bioconversion방법이 개발될 필요가 있다고 생각되어진다.

이와 같이 프로필렌으로부터 프로필렌 옥사이드 생성은 메탄을 산화하는 박테리아인 메탄자화균에 의한 생전환(bioconversion)에 의해 이루어질 수 있는데 본 연구에서는 메탄자화균의 에폭사이드 생성을 최적화하여 이들 생합성과정의 상업적 응용가치를 규명하고자 한다.

이를 위해 ATCC 19069 Methylococcus capsulatus를 이용하여 프로필렌을 프로필렌 옥사이드로 전환하는 경우에 있어서 propylene 소비속도에 대한 Michaelis-Menten parameter에 의한 kinetic study 및 methane에 의한 propylene 전환 저해 메카니즘 및 저해상수 규명, 그리고 formaldehyde, formate, methanol, methane등의 co-substrate에 의한 propylene 최대 conversion 속도등을 조사하였다.

실험

본 연구에서 사용된 Methylococcus capsulatus ATCC19069는 ATCC로부터 구매하여 사용하였으며 균체 배양용 배지의 성분은 nitrate, phosphate염과 MgSO4, FeSO4 및 trace element와 미량의 vitamin들이고 사용한 chemical은 모두 sigma사 제품이었다. 이 배지는 0.22□ filter를 이용하여 멸균하였다. 균체배양에는 Crimp seal이 있는 150□짜리 serum bottle이 이용되어지며 이 병에 45□의 배지와 5□의 seed culture를 넣고 나머지 공간은 원하는 양의 메탄과 산소 그리고 tracer로의 약간의 질소를 원하는 압력으로 채워 실험하게 된다. 메탄, 산소, 프로필렌 그리고 질소는 0.22□ filter를 통해 주입하며 serum bottle은 분당 200회 회전운동을 하는 진탕배양기(vision 과학)에 넣어 37℃에서 배양하였다. 이때 사용한 메탄과 프로필렌은 99.9%의 순도이었다. 성분 정량을 위한 propylene oxide는 sigma사 제품을 사용하였다.

세포농도는 분광광도계(Milteon roy. spectronic 21) 368nm에서 구한 흡광도를 나타내었다. 메탄과 산소, 질소 그리고 프로필렌 분석은 가스크로마토그래피(Donam,DS6200)에서 수행하였다. 사용된 칼럼은 길이 6 ft의 녹슬지않은 stainless steel이고 충진 물질은 Molecular sieve 13x(CRS) 이었으며 TCD detector를 이용하였다. 실험 조건은 injector 150℃ oven 은 45℃에서 251℃까지 20℃/min속도로 승온 시켜 사용하였고 carrier gas로는 He gas를 20cc/min로 흘려주었다. 프로필렌 oxide분석에 사용된 충진물질은 HayeSep Q(CRS)이며 FID detector, 온도는 200℃이었다. carrier gas로 He을 30cc/min로 흘려주었다.

결과 및 토론

Methylococcus capsulatus ATCC 19069에 의한 propylene으로부터 propylene oxide 생성능력 및 이에 관한 여러 가지 영향에 관하여 실험하였다.

먼저 propylene 소비속도에 대한 kinetic model과 그에 따른 여러 가지 상수값을 계산하기 위한 실험을 수행하였는데 Fig.1에서는 propylene의 농도에 따른 소비속도를 나타내었다. propylene의 소비속도는 낮은 농도에서 선형적으로 증가하지만 농도가 높아짐에 따라 점차 최대치에 도달하는 경향을 보였고, 이는 enzyme kinetics에서 잘 알려진 속도식인 Michaelis Menten식이 적용되어진다.

Vmax와 Km을 얻기 위해 1/V vs. 1/S를 도시(Lineweaver-Burke plot)하였으며 이 결과를 Fig.2에 나타내었다. slope 값 Km/Vmax 및 y-intercept 값 1/Vmax로부터 Vmax와 Km은 각각 1.2mmol/L-hr-O.D., 1.704 mM 임을 알 수 있다.

또한 propylene의 소비에 대한 메탄의 저해 정도를 조사하기 위하여 20 mM formate 존재시 Michaelis-Menten kinetic model을 사용하여 메탄의 저해상수(Ki)를 측정하였는데 그 결과가 Fig.3에 Lineweaver-Burke plot으로 나타나는데 competitive inhibition의 특징을 보이며 이때 inhibition constant는 Ki = 0.889±0.026 mM 임을 알 수 있다.

앞의 실험에서는 실험중  formate를 첨가하여 MMO효소만에 대한 propylene과 inhibitor로서의 methane의 affinity를 조사하였는데 실제 propylene의 bioconversion 공정에서는 formate 첨가가 비경제적이므로 methane과 propylene의 첨가가 필수적이다. 따라서 methane과 propylene 의 feed를 이용한 실제적인 propylene bioconversion 최적화가 필요한데 이에는 앞의 실험과 다르게 methane이 propylene에 대한 competitive inhibitor의 단점 뿐만 아니라 NADH 공급원으로서의 장점을 지니게 된다.

이를 위한 기초 실험으로 최적 메탄 대 프로필렌의 비를 조사하였는데 gas phase 중 methane 대 propylene의 비가 3 : 7, 5 : 5, 6 : 4로 변하면서 methane과 propylene의 소비속도가 모두 증가하지만 7 : 3, 8 : 2로 methane의 비율이 증가하면서 메탄의 소비속도는 증가하는 반면 propylene의 소비속도는 감소함을 발견하였고, 이 결과는 Fig.4에서 확인되는데 Fig.4에서는 propylene의 gas phase 양을 0.9mM로 고정하여 수용액중 용존농도를 1.525  mmol/L로 유지하며 메탄의 농도를 변화시켜 소비속도를 측정하였다. 그림에서 보여진 것처럼 formate가 첨가되지 않은 경우에서 메탄의 gas phase양이 1.34mM일 때 즉, 수용액중 용존농도가 0.37 mmol/L일 때  propylene의 소비속도가 최대치를 갖는다. 이때의 methane : propylene의 gas phase 양의 ratio가 (1.34mM : 0.9mM) 약 6 : 4인 것을 알 수 있다. 따라서 methane과 propylene을 함께 사용하여 propylene oxide를 생성하고자 할 때는 methane : propylene의 gas phase 중의 비를 6 : 4로 유지해주는 것이 중요하리라 생각된다.

그리고 Fig.4에서는 formate 존재유무가 propylene의 소비속도에 미치는 영향이 나타나 있다. formate가 존재하지 않을 때는 메탄의 농도가 어느 한계까지 증가함에 따라 propylene의 소비속도도 증가되어 1.34mM CH4에서 propylene의 최대소비속도를 얻을 수 있었다. 그러나 그보다 높은 CH4농도에서는 propylene 소비속도가 감소되어짐을 알 수 있었고, formate가 존재할 때는 메탄의 농도가 낮을수록 propylene 소비속도가 높음을 알 수 있다. 이것은 formate가 없을 때는 메탄의 소비에 따라 NADH가 공급되어지므로 높은 메탄농도에서 메탄의 소비속도가 높아 NADH의 공급이 원활하여 이에따른 프로필렌의 소비속도도 함께 증가하다가 일정농도 이상의 메탄 농도에서는 NADH양은 증가되지만 MMO에 의한 프로필렌 소비에 대해 메탄의 방해 기작으로 인하여 오히려 프로필렌의 소비속도가 감소되어 지는 것으로 생각되어진다.  formate가 존재할 때는 formate에 의해 NADH가 충분히 공급되어지므로 메탄 농도가 증가할수록 MMO활성에 대한 경쟁적 방해기작만이 촉진되어짐으로 프로필렌의 소비속도가 계속 감소되어진다고 생각된다. formate가 첨가되지 않았을 때의 propylene의 최대분해속도는 formate를 첨가했을 경우에 비해 약 60%정도였며 이는 propylene oxide의 상업적 생성에서 고가의 formate를 첨가하지 않고 메탄만으로 배양을 할 수 있다는 경제적 가능성을 보여준 것이라 생각된다.

또한 Methylococcus capsulatus (ATCC 19069)에 의한 propylene으로부터 propylene oxide 생성능력을 알아보기 위하여 여러 가지 co-substrate의 영향에 대하여 실험을 수행하였는데 propylene과 air(50% : 50%), CH4, propylene과 air(25% : 25% : 50%) 그리고 propylene과 air(50% : 50%)에 1g/L CH3OH, 1g/L HCHO, 1g/L HCOOH를 각각 첨가하여 실험하였다.

Fig. 5, 6 에 결과가 나타나 있는데 propylene과 air만 주입한 경우는 cell의 성장이 멈추었으며 약 0.3g/L의 propylene oxide를 생성하였다. CH4, propylene, air를 같이 주입한 경우에서는 메탄의 대사로 인하여 cell 성장은 계속되었고 propylene oxide 생성은 0.65g/L의 수준이었는데 더 오랜 시간의 conversion이 계속되었을 경우 1g/L 이상의 생성도 기대되며 O.D.가 매우 낮은 경우의 실험이므로 high cell density에 의한 propylene oxide의 생성량은 매우 클 수 있다고 생각된다.

그리고 메탄을 제거하고 CH3OH, HCHO, HCOOH를 각각 첨가한 경우에는 HCOOH의 경우 cell 성장은 거의 멈추었지만 propylene oxide 생성은 1g/L 정도에서 계속 증가하는 양상을 보였고 HCHO를 첨가하였을 경우에는 세포성장이 최대를 보였으며 propylene oxide도 0.9g/L 이상 생성하였고 계속 증가하는 양상이었다. CH3OH의 경우에도 cell성장도 계속되었고 propylene oxide를 약 0.75g/L 이상 생성하였다. HCOOH 첨가의 경우 NADH공급이 가장 좋은 것으로 보여지고 메탄과의 경쟁이 없어 높은 propylene 생성량을 보이는 것으로 생각된다.

그리고 메탄과 propylene만으로 propylene oxide를 생성하여도 formate 경우의 65% 이상을 생성할 수 있음을 알 수 있었으며 고농도 균주를 이용한 높은 propylene oxide의 생성이 기대된다.

참고문헌

A. B. Hooper (1985), Microbiol, Rev., 49, 140

H. Dalton and D. Leak (1983), Microbial Gas Metabolism, Academic, New York

M. Beardmore-Gray and C. Anthony (1983), J. Gen. Microbial., 129, 923