온-라인 고농도 세포 측정 장치의 개발

정용호, 이종대*, 장용근

한국과학기술원 화학공학과

* 생산기술연구원

A New Device for On-line Measurement of High Cell Concentration

Jung Y.H., J.D. Lee*, Y.K. Chang

Dept. of Chemical Engineering, KAIST, Taejon, Korea

* Technology Business Incubator Section, KITECH, Seoul, Korea

서론

생물반응을 이용하는 각종 공정에서는 반응기 내의 세포 농도에 따라 생산성이 크게 좌우되기 때문에 조업 도중 세포 농도를 파악하는 것이 공정의 제어 및 최적 조업을 위해 매우 중요하다.

일반적으로 세포 농도의 측정 방법은 측정 장치의 자동화 정도에 따라 또는 측정 방법의 특성에 따라 오프-라인법과 온-라인법의 두가지로 대별된다. 이중 오프-라인법은 시료 채취 이후 농도를 측정할 때까지 많은 시간이 소비되고 시료 채취 도중 잡균에 의한 발효조 오염 문제를 유발시킬 수 있으며 과도한 수작업과 시료를 희석시키는 과정에서 발생하는 오차 등 여러 가지 문제점을 가지고 있으므로 최근에는 시료 채취 등 배양액의 외부 유출과 희석의 필요가 없는 온-라인 측정에 대해 많은 관심과 연구가 집중되고 있다. 그러나 지금까지 개발된 온-라인 측정 기기들은 매우 고가이고, 안정성, 반응기 내부 조건에 따른 오차 발생 등 많은 문제점을 보이고 있으므로 따라서 보다 단순한 원리에 의한, 안정성과 정확성이 뛰어난 저렴하고 실용적인 장치의 개발이 필요하다.

본 연구에서는 복사광의 투과 경로 길이를 미세하게 조정함으로써 매우 높은 세포 농도까지 측정이 가능함에 착안하여 기존의 흡광 광도계에 설치할 수 있으며 통과 경로를 자유자재로 미세하게 조절할 수 있는 밀폐형 측정 장치를 고안하고 이를 반응 장치와 연결하여 반응액이 순환하도록 함으로써 반응액의 유출과 시료 희석의 필요성이 없는 온-라인 측정 방법을 개발하고자 하였다.

실험 장치의 구성

본 세포 농도 측정 장치는 전체적으로 내구성과 내식성이 뛰어난 두랄루민을 사용하였고 기판 위에 수직으로 설치된 두 개의 판 중 하나는 기판에 고정시키고 다른 하나는 축 방향으로 자유로운 이동이 가능하도록 설계하였다. 이동판은 마이크로미터를 이용하여 정밀하게 움직일 수 있도록 하였고 고정판과 이동판은 금속봉 형태의 슬라이딩 베어링으로 연결시켜 이동판의 이동시 유발 가능한 전후 방향의 흔들림을 방지하였다. 이동판과 고정판 위의 같은 위치에 원형의 구멍을 내어 복사광이 투과할 수 있도록 하고 구멍의 내부에는 1/16인치 두께의 석영 유리판을 부착하였다. 그리고 이동판과 고정판의 간격을 변화시키는 도중에도 두 판 사이에 외부와 격리된 밀폐된 공간이 유지되도록 하기 위해 스테인리스강 링(stainless steel ring)의 외부에 고무막을 덧쒸워 이동판과 고정판에 접착시켰다. 또한 밀폐공간과 접하고 있는 고정판 상의 적절한 위치에 두 개의 구멍을 내어 튜브를 설치함으로써 반응액의 연속적인 순환이 가능하도록 하였다.

본 장치를 이용한 온-라인 농도 측정은 양 판 사이의 밀폐된 공간을 통과하여 반응기로부터 나온 반응액을 순환시키면서 두 판 중앙의 구멍 사이로 빛을 투과시켜 미생물에 의해 흡광된 양을 분석함으로써 이루어진다. 이때 복사광의 광원과 검출기로는 미국 휴렛 페커드사의 HP-8453 분광광도계를 사용하였다. 마이크로미터를 이용하여 두 판 사이의 거리를 원하는 값으로 조절한 후 복사광을 투과시켜 측정되는 흡광도를 컴퓨터에 입력시켰다. 같은 농도에 대해 동일한 과정의 측정을 반복함으로써 재현성 여부를 조사하였다.

Fig. 1. A Newly Developed Flow-cell

결과 및 토론

세포 농도 측정 실험을 위해 구형의 형태를 갖는 효모와 실관형의 형태를 갖는 Lactobacillus의 두 균주를 사용하였다. 세포 농도 측정 장치의 유효 복사광 투과 길이를 47□m로 했을 경우 Fig. 2와 3에서 효모와 Lactobacillus에 대해 각각 40 g/L와 33 g/L의 농도까지는 선형성을 나타내고 그 이상의 농도에서는 이전과 다른 기울기를 갖는 것을 알 수 있다. 40 g/L 이상의 세포 농도에 대해서도 비선형적인 관계식을 사용한 fitting이 가능하다. Fig. 2와 3에 포화형 표현식(Saturation type equation)을 이용한 regression 결과를 도시하였다. 포화형 표현식의 기본 형태는 다음과 같다.

[eqn: 세포 ~농도 ~=~ {a TIMES OD} over {b + OD}]

위 식에 의해 Fig. 2에서는 약 150 g/L까지, Fig. 3에서는 80 g/L까지 세포 농도를 예측할 수 있지만 80 g/L 이상의 농도에서는 regressing curve의 기울기가 매우 낮다. 따라서 측정한 흡광도가 약간의 오차를 수반하더라도 그 값을 세포 농도로 환산하게 되면 원래의 세포 농도와 큰 차이가 나타나게 된다. 그러므로 약 80g/L 이상의 세포 농도에서는 이러한 오차의 증폭 현상으로 인해 실제 적용은 불가능할 것으로 생각된다.

세포 이외 용존 물질의 측정으로서 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA) 수용액의 측정 실험을 수행한 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 본 측정 장치를 이용하여 측정했을 때 약 100g/L 이상까지 BSA 농도 측정이 가능함을 알 수 있다.

중공사막을 이용한 Lactobacillus의 고농도 연속 배양시의 발효조 내 세포 농도의 시간에 따르는 변화를 본 장치를 이용하여 온-라인 측정하였다. 전세포 재순환(total cell recycle) 방식을 채택한 결과 52시간만에 세포 농도가 약 60 g/L까지 증가하였다. 배양 도중 본 장치를 사용하여 측정한 흡광도와 미리 얻어진 흡광도-세포 농도 표준곡선으로부터 계산된 세포 농도와 직접 측정한 세포 농도를 Fig. 5에 나타내었다. 전체적으로 온-라인 측정 장치를 이용하여 측정한 값이 실제 세포 농도와 비교적 잘 일치하는 결과를 나타내었다.

Fig. 2. Absorbance vs. Yeast Conc.	Fig. 3. Absorbance vs. Lactobacillus Conc.

Error Bars : 5 Repeated Experiments	Error Bars : 5 Repeated Experiments

Fig. 4. Absorbance vs. BSA Conc.     Fig. 5. Comparison of DCW and Cell	Conc. Measured by Using Flow Cell

□ : DCW (g/L)

□ : Cell Conc., flow cell (g/L)

참고문헌

1. Junker B. H., Reddy J., Gbewonyo K., and Greasham R., (1994) On-line        and in-situ monitoring technology for cell density measurement in	microbial and animal cell cultures. Bioprocess Eng. 10, 195-207

2. Hobson N. S., Tothill I., and Turner A. P. F., (1996) Microbial                detection. Biosensors & Bioelectonics 11, 455-477