Candida cylindracea 유래의 Lipase에 의한 유지(Fat)의 가수분해

김 동 준, 김 은 기*, 허 병 기**

인하대학교 생물공학과 환경응용 생물공학실*, 시스템 공학 연구실**

Lipid(Fat) Hydrolysis by Candida cylindracea Lipase

Dong-Jun Kim, Eun-Ki Kim*, Byung-Ki Hur**

Environ. Biotech. Lab.*, Biosys. Eng. Lab.**, Inha Univ. Inchon, Korea

서론

현재 유지의 분해에 사용되는 방법으로는 고온 고압법(Colgate-Emery Process), 알칼리 분해법, 알콜리시스법, 효소적 가수분해법 등이 알려져 왔다. 그러나 가장 많이 사용되고 있는 방법 중의 하나인 Colgate-emery Process는 높은 에너지 소모, 큰 설비, 낮은 품질의 지방산 생성, 폐수의 발생이라는 문제점을 안고 있다(1). 따라서 이 문제를 해결할 수 있는 효소에 의한 지방의 가수분해로 이러한 문제점을 극복하여 고품질의 지방산 생성에 관한 연구가 활발히 진행 중에 있다(2). 이러한 연구의 일환으로 광학활성을 지닌 알콜 등의 생산에 현재 많은 연구가 진행 중에 있다.

그러나 본 실험은 그 중에서 유지를 가수분해하여 공업적으로 사용할 수 있는 지방산의 생성에 초점을 두었다.

이론

유지의 분해 산물로는 지방산과 글리세롤이다. 이 생성된 지방산은 비누, 화장 품 및 식품유화제 등의 원료로 사용되고 글리세롤은 보습제로서 담배 등에 사용 된다.

리파제(EC. 3.1.1.3)는 미생물, 동물 그리고 식물에서 생성이 되지만, 현재 사용 되고 있는 대부분은 미생물 유래의 리파제이다. 리파제는 트리글리세라이드의 에스테르 결합을 가수분해하거나 합성 또는 지방산의 위치를 바꾸게 하는 트랜스에스터리피케이션 등의 작용을 하는 효소이다(3). 미생물 유래의 리파제의 경우는 동물이나 식물에서 얻어지는 것에 비하여 생산비가 적게 들며 대량 생산이 가능하므로 그 잠재성이 매우 크다.

리파제는 그 성질에 따라서 트리글리세라이드의 세 지방산기에 대하여 비특이적으로 가수분해를 하는 것으로 세 아실기를 모두 절단하므로 가수분해에 사용되고 특정 위치의 지방산(1,3 위치)을 분해하는 특이적 리파제로 에스터화나 에스터 합성용으로 사용되는 리파제로 구분할 수 있다(4). 가장 많이 사용되고 있는 미생물 유래의 리파제로는 Candida cylindracea 유래의 리파제로서 효모에서 근원된 리파제로서 비특이적으로 세 개의 아실기를 절단하는 리파제이다.

리파제에 의한 효소반응은 두 반응물인 수용액 층과 유지 층의 계면반응으로  산업적으로 이용되고 있는 예로서는 치즈의 숙성, 화장품에서 피부 지방 제거를 위한 크림 생산 등에 이용되고 있으며 현재 특수 화학 분야에서는 광학활성을 지닌 스테레오 이성질체의 생산에 관한 연구가 활발하게 진행 중에 있다(2,5).

실험

Candida cylindracea 유래의 리파제인 Lipase OF 360,000은 일본의 MEITO社에서 구입을 하였고 Aspergillus oryzae 유래의 1,3-특이적 리파제인 Lipolase 100T는 덴마크의 NOVO社에서 구입하였다. 위의 두 효소는 더 이상의 정제없이 사용되었다.

또한 가수 분해를 위한 지질은 (주)무궁화에서 제공받았으며 그 이외의 시약은 시약 등급의 것을 사용하였다.

분해 산물의 분석은 일본 IATRON 社의 TLC/FID IATROSCAN MK-5를 사 용하였다(6).

리파제의 활성 단위(Activity units)는 Olive oil을 기질로하여 gum arabic을 유화제로 사용하여 단위시간(min) 당 지방산 1□mol을 생성하기 위한 효소의 량(g)으로 정의하였다. 이 때 생성된 지방산의 량은 modified cupric acetate 法에 의하여 측정하였다(7).

본 실험에서는 리파제의 반응 최적화를 위하여 상대적으로 가격이 고가인 Lipase OF(Kg 당 26,000￥)와 비교적 가격이 저렴한 Lipolase 100T(Kg 당 23$)의 조성비를 달리하여 두 효소의 혼합 사용에 따른 상승효과 여부를 규명하였다(6).

또한 가장 중요한 매개변수인 수분함유량, 온도효과 등에 대하여 실험을 실시하였다.

실험 조건으로는 버퍼 대신 증류수를 사용하였으며 250rpm에서 48시간 동안 반응을 진행하였고 온도는 42℃와 48℃사이에서 변화시켰다.

결과 및 토론

먼저 여러 변수들 중에서 물의 량이 가수분해에 미치는 영향에 관한 실험 결과는 다음과 같다.

위에서 보는 바와 같이 Lipase OF 360,000은 물의 량이 무게비로 유지의 1:1인 경우 가장 좋은 가수분해율을 나타내는 반면, 특이적 효소인 Lipolase 100T의 경우는 유지:물의 비가 3:1인 경우가 가장 좋았다. 이 결과는 특이적 효소인 Lipolase 100T의 경우 단지 48시간의 반응으로 전체 기질의 40% 정도를 가수분해하는 것을 비추어 보면 이론상으로는 67%의 가수분해가 일어나는 것이 정상적인 것으로 예측되나 산물의 저해작용(product inhibition)이나 기질의 저해작용에 의하여 그 이상의 가수분해를 일으키지 못하는 것으로 보인다. 따라서 반응기 내의 수분함유량이 적을수록 이 효소의 작용에 최적의 조건을 나타낸다고 볼 수 있다.

다음으로 두 가지 효소를 혼합하여 실험한 결과 경제적인 측면을 고려하여 볼 때, 비교적 값이 싼 특이적 효소의 량을 증가시키면서 값이 비싼 비특이적 효소를 소량 반응기내로 투입할 때, 두 효소의 조합으로 인한 상승작용은 기대할 수 없었다. 이것은 Lipase OF 360,000의 초기 활성이 Lipolase 100T에 비하여 월등히 뛰어나 100T의 작용을 할 수 있는 1,3번 위치의 지방산을 가수분해한 결과라고 생각된다.

또한 앞의 실험을 기초로 하여 온도에 의한  효소의 작용에 대한 실험을 한 결과 다음과 같은 양상을 볼 수 있었다. 일반적으로 알려진 이 비특이적 효소의 안정성은 Lipase OF 360,000이 30℃에서 50℃의 범위에서 열에 안정하고 특히 37℃에서 Olive oil에 대하여 최적의 반응을 나타내는 것으로 알려져 있으나 반응에 사용된 기질인 Fat의 melting point가 41℃임를 고려하여 반응을 진행시킨 결과 반응에 대하여 가장 최적의 온도는 45℃ 부근 이었다는 것을 알 수 있었다.

반응이 진행됨에 따라 중간생성물의 하나인 다이글리세라이드와 모노글리세라이드는 초기에는 소량의 증가에 따라 일정량이 관찰이 되지만 반응이 진행됨에 따라 그 량이 감소됨을 알 수 있는데 그것은 비특이적 효소인 Lipase OF 360,000이 일단 공간적인 이점으로 1,3번 위치의 지방산을 먼저 분해한 후, 그 후에 반응의 중간 생성물인 이 두 물질의 분해를 선호하는 지방산 특이성에 기인한다고 볼 수 있다.

참고문헌

1. Yong K. Park, Glaucia M.Pastore, Marta Mitsui de Almeida, JACOS,          Vol.65, No.2 (1988) 252-254

2. 岩井美枝子, 油脂 Vol.43, No.3, (1990) 83-92

3. Carl Miller, Helen Austin, Larry Posorske and Jesus Gonzlez, JACOS, Vol.     65, No.6 (1988) 927-931

4. Tsuneo Yamane, Mohammad Mozammel Hoq., Sumiyo Itoh, Shoichi            Shimizu, 油化學, Vol.35, No.8 (1986) 625-631 pp.45-51

5. Y.Kodera, H.Nishimura, A.Matsushima, M.Hiroto, Y.Inada, JACOS, Vol.71,      No.(3) (1988) 335-338

6. K.Holmberg, E.Osterberg, JACOS, Vol.65, No.9 (1988) 1544-1548

7. Yasuhiro Naka, 油化學, 第36卷 第12號 (1985) 1017-1020 (21-24)