패각형성에 미치는 결정내부단백질의  영향에 대한 연구

김용완,윤승열,최청송

서강대학교 화학공학과

Interation of intracrystalline components extracted from oyster shell with calcite crystal

Yong-Wan Kim, Seoung-Yul Yun, Cheong-Song Choi

Dept. of Chemical Engineering, Sogang University

1.서론

패각의 결정성장에 있어서 생물학적 제어의 가장 중요한 요소는 결정과 혼재하는 미량의 거대분자군(macromolecules)의  영향이다.  이때 결정성장의 일반적 방식은 결정이 연속적으로 성장할  수 있는 구조적 골격(organic matrix)의 초기형성을 통하는 것이며  결정성장은  이러한 matrix template에서  epitaxial process에 의해 일어난다. 그리고 결정성장의 조절은 부분적으로 거대분자군의 배열로 이루어진다.  TEM을 이용, organic matrix조성이 패각의 바깥표면에 주로 존재함을 알 수 있으며 결정과 직접 접촉하고 있는 것이 확인되었다.[1]

패각내에서 생성된 결정은 성장할 때 제약받은 공간의 모양에 의해 주로 결정된 것으로 보이는 독특한 형태를 가지고 있다.  초기 패각의 성장세포는 단백질과 탄수화물로 주로 이루어진 세포와 구조적 골격을 형성하며 aragonite나 calcite 는 미리 형성된 이와같은 골격내에서 핵생성과 성장이 이루어지게 된다.   결정형태를 조절할 수 있는 방법은 임의의 결정면과 선택적으로 상호작용하는 특정 거대분자군에 의해서이다.   이것은 패각류의 생물체가 결정성장의 미세환경에서 정교한 제어를 함을 알  수 있다.[2]

이러한 연구로부터 무기고체상(inorganic solid phase)과 거대분자군 사이에 긴밀한 구조적, 화학적 관계가 존재한다고 결론지을 수 있다.  따라서 결정과 matrix protein과의 선택적 특성에 대한 결정학적 연구는  이와같은 패각의  biomineralization 이해및 응용연구에 방향을 제시할 수 있으리라고  생각된다.

본 연구에서는 폐패각인 굴껍질을 이용하였으며 이때 패각의  각 부분에서 추출한 거대분자군의 존재하에서 calcite 결정을 키웠으며, 사용된 유기층의 major group중 하나인 carboxylate와  선택적 상호작용이 일어나는 결정면의 입체화학적 특징을 살펴 보았다.  또한 합성calcite결정과 패각을 재결정해서 얻은 calcite결정을 사용, 비교분석하였다.  이와같이 투석과 FPLC를 통해 추출,정제된 거대분자군이 합성결정과 biogenic 결정의 성장에 미치는 영향을 분석함으로서 상호작용을 지배하는 법칙과  organic matrix가 패각내에서 결정성장을 조절하는 메카니즘에 대한 상호관계를 제시하려 한다.

2.실험

습식 물리적 처리를 거친 굴껍질을 깨끗하게 부순후  2차 증류수(1□ powder/10□)에 섞는다. HCl(2mol HCl/1mol powder)을 microcapillary pipette를 이용하여 3-4시간이 소요되도록 소량 넣으면서 용해시킨다. 이때 마지막 용액의 pH는 6.7이 되게 한다.  황산으로 표면처리된 길이 2□ coverslip을 지름 5.5□ 결정성장cell에 놓고 위의 용액을 붓는다. (NH4)2CO3를 담은 용기와 함께 cell을 desicator에 넣는다.  아주 느린 (NH4)2CO3확산을 통해 calcite가 재결정되게 한다.   3일후  결정이 붙은  coverslip을 물이나 메탄올로 세척후 SEM으로 조사한다.  또한 7.5mM, synthetic CaCl2를 이용하여 같은 조건으로 실험하여 성장시킨 calcite결정과 pH 8.3인 인공바닷물(0.5M  NaCl, 11mM KCl, 10mM CaCl2·2H2O, 8mM NaHCO3)을 이용하여 성장시킨 calcite결정을 이용하였다.   투석과 FPLC를 통해 분리정제된 macromolecule을 FTIR을 이용하여 특성을 규명하였고 실험에 직접 사용하였다.  또한  glycoprotein(SIGMA), 패각에서의 주요 이온성분인 magnesium chloride(SIGMA)을 각각의 용액에 양을 변화시켜가며 투여하여 성장하는 결정을 SEM, XRD 를 이용, 분석한다.

3.결과 및 고찰

실험적으로 굴껍질의 결정성장 환경을 정확히 재현할 수는 없다.   따라서 각각 다른 결정성장환경에서 준비된 결정과 폐패각에서 추출한 단백질을 이용, 분자수준에서 상호관계를 유도하였다.  단백질의 backbone에 결합되어 있는 다당류의 sulfate군이 칼슘이온을 concentration하게 하고 이것은 □-form을 형성하고 있는 carboxylate domain상에서 calcite의 핵생성에 필요한 과포화를 생성하게 된다.[3]

단백질의 영향없이 성장시킨 calcite결정(그림1)은 Rhombohedra 결정계(a,b=4.989Å, c=17.062Å, □,□=90o,□=120o)를 가지고 있으며 calcite의 구조는 c축을 따라 calcium과 carbonate이온이 교대로 층을 형성하는 특성을 가지고 있다.(그림2)  평면구조의 carbonate이온은 {001}면에 수평으로 위치한다.   단백질이 없는 상황에서 성장한 calcite결정은 고유의 {104}면으로의 쪼개짐특성을 가지며 단백질은 결정 fracture의 전이에 영향을 미친다.

패각을 재결정시켜 성장시킨 calcite결정을 SEM분석을 통해 확인하였다.(그림3)   또한 synthetic calcite결정의 포화용액을 굴껍질결정이 완전 용해된 용액에 넣어 결정을 성장시켰다.  이렇게 함으로서  결정이 성장하는 동안 새롭게 형성된 결정은 용액으로 스며든 패각형성에 기여한 모든 결정내부단백질과 상호관계를 가진다.  사용된 굴껍질은 투석과  ion-chromatography를 통하여 아미노산분석결과, aspartic acid와 glysine이 풍부한 단백질(0.1% by weight)을 함유하고 있다.  따라서 이러한 환경에서 성장된 결정은 단백질의 영향이 없었던 합성결정과 비교분석하여 적은 수의 부드럽고 둥근 표면으로 형성되었으며 특히 단백질의 농도가 높은 성장환경일수록  agglomeration된 형태를 띈다.(그림4)

calcite의 구조에서 결정내부단백질과 calcite가 가장 입체적으로 잘 맞는 면은 {001}면이다.  calcite결정내에서 칼슘이온사이의 평균적 거리는 5±1.5Å이며 일반적으로  □-form을 형성하고 있는 단백질에서 carboxyl기의 평균거리는 6.95Å인 관계가 있다.[4]  즉 결정성장에 영향을 미치는 단백질의 아미노산배열에서 두개의 산소이온이 붙어있는 carboxyl군이 가장 잘 접근할 수 있는 면은 calcium면에대해 수직인 방향인 {001}면이다. 특히 패각을 HCl로 decalcification시킨 용액내에서가 아닌 CaCl2 수용액에서 증기상으로 성장시킨 synthetic calcite는  주입된 결정내부단백질이  3□/□을 넘을 경우 핵생성이 억제되어 아주  적은 수의 결정이 응집되어 있는 것을 보였다.  격자구조에서 {001}면은 calcium과  carbonate이온이 교대로 층을 형성하고 있다.  따라서 {001}면들은 많은 부위가 국소적 음/양전하을 띄게 되어 본질적으로 불안정하게 된다. 따라서 결정면의 칼슘이온과 단백질의 carboxylate이온이 정전기적 인력에 의해 안정하게 될 수 있다. 이러한 결합으로 {001}면으로부터 배향된 결정의 핵생성이 유발된다.  결정조직검사(x-ray)를 통해 [001]방향으로의 coherence length의 감소를  확인했다.   따라서 {001}면으로 흡착된 거대분자군의 존재를 확인했으며 aspartic acid를 다량 함유한 단백질의 분자구조는 calcite결정의 격자변수와 긴밀한 상호관계가 있음을 알 수 있다.

패각에는 칼슘 95.39%, 알루미늄 0.12%, 인 0.11%, 마그네슘 0.66%, 규소 0.42%가 함유되어 있으며 이러한 함량은 패각의 종류마다 다르게 나타난다.   결정내부단백질과  마그네슘이 어떻게 상호 협동하여 biogenic calcite형성에 기여하는지 제대로 알려지지 않았지만 마그네슘은  calcite와 {011}에서 선택적으로 작용한다고 알려졌다.  실험에서는 MgCl2의  양을 변화시키며 실험하였다.

마그네슘/칼슘의 비가 4//1이 넘으면 argonite가 형성된다. 즉 마그네슘의 영향은  칼슘의 절대농도에 의존한다. 즉 칼슘농도가 일정량을 넘으면 calcite표면은 칼슘이온으로 포화되어 마그네슘의 흡착능력이 감소함을 의미한다.   energy calculation[5]를 통해 mg는 calcite의  {100}면으로 선택적 흡착된다. 그러나 실험적으로 이러한 결정면확인이 어려운 이유는 Mg ion주위의 hydration layer가 강하게 결합되어 있기때문으로 생각된다. 따라서 Mg이온의 dehydration정도에 의해 {100}면의 결정성장정도가 결정된다.  따라서 {011}면은 음/양 patch로 전하가 반전되어있기 때문에 {100}면 다음으로 좋은 흡착면이 될것이다.    특히 양이온을 형성하는 부위는 접근하는 커다란 수화된 마그네슘 이온을 정전기력으로 당기기에 충분하다.

결정내부단백질을 더욱 분리,정제하여  패각의 결정성장에 독립적으로 미치게  되는 영향을 조사할 필요가 있다. 각각의 결정내부단백질이 서로 다른 결정조직에 미치는  영향이나,  biogenic 결정의 알려진  특성에  대한 영향들을  조사하면  복합물질을 제조할 때 구조-기능관계에 방향을 제시할 수 있다.

참고문헌

1. Stephen, W., Biochemistry, 22,4139,1983

2. Aizenberg, J., FASEB, 9, 262, 1995

3. Addadi, L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82,4110,1985

4. Stephen, W., Science, 190,987,1975

5. Titiloye, J.O., J.Chem.Soc.,Chem.Commun. 1494,1991

그림 1	그림 2

그림 3                                그림 4