무공해 생물 살충제를 위한 곤충 병원성 선충의 배양

김  도  완, 박  선  호

계명대학교 공과대학 화학·재료공학부

Culture of Entomopathogenic Nematodes for an

Unpollutant Biopesticide

Do Wan Kim, Sun Ho Park

School of Chemical Engineering & Material Science, Keimyung University

서  론

농작물의 수확에 막대한 피해를 주고, 생산 원가를 증가시키는 원인인 해충의 구제를 위하여 지금까지 주로 화학적인 방법으로 생산되는 살충제에 의존해 왔으나 살충제에 대한 해충의 저항력이 강해져 그 사용량이 날로 증가, 생태계의 파괴로 인한 환경문제 유발, 농작물에 대한 농약 성분의 잔류 등 그 부작용이 심각해지고 있다.

최근 이를위해 주목 받고 있는 생물학적 살충제중 곤충 병원성 선충류는 넓은 기주 범위와 뛰어난 기주 탐색 능력이 있고, 토양속이나 물속 등 화학적 농약이나 병원 미생물의 침투가 곤란한 서식처에서도 효과를 잘 발휘하고, 인체에는 전혀 해가 없기 때문에 미래의 무공해 생물농약으로 기대되어 그 연구가 매우 활발히 진행되고 있다[1, 2]. 이중에 특히 Rhabditida 목에 속하는 Steinerne- matid는 공생 박테리아인 Xenorhabdus spp.와 함께 해충의 입, 항문, 기문 등을 통해 해충 혈장에 침투하여 해충 내부에서 공생 bacteria가 독소를 생성하여 24∼48시간내에 해충을 사멸시키는데 대량 배양이 용이하고 장기간 보관이 가능한 장점을 갖고 있다[3].

본 연구에서는 곤충 병원성 선충을 이용한 무공해 생물농약의 국내 개발을 위하여 Steinernematid 종중에 해충의 사멸 능력이 매우 뛰어나고 증식 및 수확이 용이한 것으로 알려진 Steinernematid glaseri에 대하여 선충의 생육 및 병원성 발현에 영향을 미치는 주요 요인들 및 선충이 유충에 접종된 후 유충 내부에서의 증식과정 등을 조사하였다.

실  험

1. 선충의 준비 및 배양

본 연구에 사용한 선충은 국내에서 서식하고 있는 Steinernema glaseri Dongrae strain으로 경상대학교 농생물학과 선충 연구실로 부터 분양 받았으며 in vivo 배양법은 다음과 같다. plastic petri dish에 꿀벌부채명나방 유충(Galleria mellonella larvae) 10마리를 넣고 활성이 강한 3단계 선충(IJ ; Infective Juvenile)을 200마리/mL 정도로 현탁 희석한 후 고르게 뿌려 접종시키고, 25℃ incubator에서 5∼7일간 보관한다. IJs의 수확을 위해 멸균된 glass petri dish 속에 시계접시를 놓고 멸균된 여과지 1장을 증류수와 접촉할 수 있게 접은 후 그 위에 죽은 유충 20마리 정도를 올려 놓는다. 그 후 3∼4일 경과되면 선충은 유충 사체로부터 빠져나와 water trap으로 들어와 수확이 시작되는데 수확된 선충은 0.1% formalin과 증류수 세척 후 tissue culture flask에 넣어 선충 현탁액의 깊이를 1cm 이하로 하여 10℃ 냉장고에 보관하였다가 실험에 사용하기전에 실온에 방치하여 활성을 회복시킨후 사용하였다.

2. 생육조건에 따른 선충의 병원성 발현과 수확량 조사

온도변화에 따른 곤충 기생 선충의 병원성 발현 조사를 위해 유충 1마리당 IJs의 농도를 0, 10, 30, 50, 100마리로 변화시킨후 접종하여 각각 17, 21, 25, 29, 33, 37℃의 incubator에 넣은후 시간 경과에 따른 유충 사멸율과 일정 시간 동안 유충을 사멸시키는 선충 농도를 조사하여 LT50, LC50 값을 구하였으며 선충 수확용 water trap을 설치하여 각 온도 조건과 접종 선충농도에 따른 IJs의 수확량을 조사하였다.

또한 선충을 pH 4.0∼9.0 범위에서 유충에 접종하여 pH에 따른 선충 병원성 발현에 미치는 영향을 조사하였고 다양한 NaNO3 농도에 선충을 침지시킨후 접종하여 salt 농도에 따른 유충 사멸 능력을 조사하였다. 선충수는 1mL pipette을 이용하여 eel worm counter에 적절히 희석된 선충 현탁액을 2mL을 부가한 후 현미경 상에서 3회 반복하여 측정하였다.

3. 유충 내부에서의 선충 증식과정 조사

온도 변화에 따른 유충 내부에서의 선충 증식과정을 조사하기 위해 꿀벌부채명나방 유충 10마리에 활성이 강한 IJs을 1mL당 800마리로 희석하여 고르게 접종한후 수분 손실을 막기위해 비닐봉지로 느슨하게 싸고 20, 25, 29, 33℃의 incubator에서 각각 선충을 증식하였다. 유충이 사멸된 후부터 매일 유충을 해부하여 선충의 증식 과정을 관찰하였다.

또한 유충의 생체중량 변화에 따른 유충 내부에서의 선충 증식을 조사하기 위해 활성이 강한 IJs를 생체중량 18±3mg과 25±3mg에 각각 80마리씩 접종한 후 18±2℃에서 배양하며 유충 사멸후 이틀 간격으로 유충 사체를 해부하여 선충 증식 과정을 조사하였다. 선충수는 각 온도 별로 3마리의 유충을 해부한 후 그 평균값을 구하였다.

결과 및 토의

온도와 선충 접종 농도를 변화시킨 후 시간 경과에 따른 유충의 사멸율을 조사한 결과를 Table 1에 나타내었는데 17℃와 37℃에서는 모든 접종 농도에서 병원성 발현을 하지 못했으며 33℃에서 평균 LT50 값이 20 시간으로 가장 좋은 사멸율을 보였다. 또한 같은 온도에서 선충의 접종 농도를 변화시켰을 때 유충당 선충을 100마리로 접종했을 경우가 10마리 접종 농도 군에 비해 LT50 값이 최소 5시간 이상의 차이를 보였다. 한편 평균 사멸 시간을 기준한 LC50 값은 대체로 온도 증가에 반비례하여 감소하고 있으나 33℃에서는 고온의 영향으로 약간 증가하는 것을 보여주고 있다.

Table 2는 선충 접종 변화에 따른 꿀벌부채명나방의 유충 10마리당 수확되는 선충수를 나타낸 결과이다. 모든 실험구에서 수확 개시 6일 이내에 전체 수확량의 50% 이상이 수확되었으며 대체로 유충 1마리당 접종된 선충수가 높을수록 수확되는 선충수도 증가하였다. 그러나 100마리를 접종한 실험군에서는 오히려 수확된 선충수가 제일 적었는데 그 이유는 선충 접종 농도가 너무 높으면 선충끼리의 경쟁 관계 형성과 영양성분의 부족으로 번식에 방해를 받는 것으로 판단된다.

Fig. 1은 온도 변화에 따른 유충 내부에서의 선충 증식 곡선을 시간 경과에 따라 나타낸 것으로 IJs가 유충 내부에 침입한 후 성충으로 증식하는데 약 4일 정도 소요되었으며 그 후 3일 경과 후 배란이 시작되어 새로운 IJ로 증식하는데 소요되는 시간은 유충에 접종된후 9일 경과 시점이였다.

Fig. 2는 유충의 생체중량에 따른 유충 내부에서의 선충의 증식 곡선을 나타낸 것으로 생체중량 18±3mg 군에서는 IJ 접종후 6일 경과 시점에서 처음으로 성충 1마리가 발견되었으며 8일 경과 시점에서 IJs가 발견되었다. 반면에 생체중량 25±3mg 군에서는 4일 뒤인 12일 때부터 IJs가 처음 발견되었고 유충 1마리당 최대 성충수는 9마리로 비슷하였으나 최대 성충수에 도달하는데 소요되는 시간은  4일 정도 더 걸렸다. 전체 IJ 수를 비교해 보면 생체중량이 가벼운 18±3mg 군에서 400,000마리 정도로 비교 군에 비해 약 2배 가량 많았다. 성충 한 마리가 생산하는 IJ의 수를 비교해 보면 생체중량 25±3mg 군이 약 9,300마리였는데 비해 18±3mg 군에서는 약 14,800 마리로 나타났다.

감  사

이 연구는 1996년도 교육부 1996년 생물화학공학 학술연구비지원에 의한 결과 이며 이에 감사 드립니다.

참고문헌

1. Gaugler, R. and Kaya, H. K.: "Entomopathogenic Nematodes in Biological      Control", CRC Press, Florida(1990).

2. Kaya, H. K.: Annu. Rev. Entomol., 38, 181(1993).

3. 김도완, 추호렬, 박선호: 계명대학교 환경과학논집, 1(1), 301(1996).

Table 1. Infective of Steinernema glaseri infective juveniles to Galleria mellonella               larvae.

온 도	17℃				21℃				25℃
접종선충수	10	30	50	100	10	30	50	100	10	30	50	100
LT50 (hr)	-	-	-	-	47.5±1.4	43.9±0.9	40.2±2.5	34.6±3.1	37.6±1.9	32±1.6	27±3.2	25.5±1
LC50 (선충수)	-				42±3.8				36±6.5
온 도	29℃				33℃				37℃
접종선충수	10	30	50	100	10	30	50	100	10	30	50	100
LT50 (hr)	25±1.8	23.3±1.3	21.3±2.6	20.5±5.5	23.4±1.6	20.1±2.6	18.7±1.3	17.3±5.4	-	-	-	-
LC50 (선충수)	22±7				26±7				-

Table 2. Effect of nematode inoculation concentration on the total number  of                  Steinernema glaseri infective juveniles harvested at 25℃ using 10 larvae

of Galleria mellonella.

접종 선충농도/유충 수확시간(일)	10	30	40	60	80	100
1∼5	8,400	29,100	55,800	203,500	35,600	2,000
6	26,000	150,000	254,672	6,000	230,000	59,370
7	0	76,200	66,000	21,900	66,400	0
8	0	0	24,000	94,500	318,000	0
9∼10	130,000	0	0	63,000	11,088	1,300
11∼13	0	0	990	46,250	0	0
14∼15	0	0	0	3,640	0	0
수확된 총 선충수	164,400	255,300	401,462	438,790	661,088	62,670

Fig. 1. In vivo growth of nematodes.       Fig. 2.  Effect of larva weight on

(18±3mg G. mellonella larva, 18±2℃,                  nematode growth

concentration of 100 IJs per larva)          (●) 18±3mg G. mellonella larva,

(□) 25±3mg G. mellonella larva,

16±2℃, inoculation concent-

ration of 80 IJs per larva.