갈락토오즈 배지에서 재조합 효모 성장 모델링

나 정걸, 장 용근, 정 봉현*

한국과학기술원 화학공학과, 생명공학연구소*

Kinetic Modeling of Recombinant Yeast Growth in Galactose Medium

Jeong Geol Na, Yong Keun Chang, and Bong Hyun Chung*

Department of Chemical Engineering, KAIST,

Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KIST*

서 론

일반적으로 재조합 균주는 인간이 임의적으로 만든 염색체를 균체에 넣은 것이므로, 그 외래 유전자가 발현되는 과정에서 이를 포함하는 플라스미드의 안정성이 점차로 떨어지게 된다. 따라서 일단 세포를 고농도까지 배양한 후, inducer를 넣어 외래 유전자를 발현하는 이단계 배양법이 선호된다. GAL 프로모터를 갖는 재조합 효모의 경우 세포배양기에는 포도당이 탄소원으로 사용되고 유전자 발현기에는 갈락토오즈가 inducer인 동시에 탄소원으로 사용된다. 포도당이 탄소원으로 이용될 경우, Crab tree 효과와 Pasteur 효과로 인하여 에탄올이 발생하게 되며 생성된 에탄올은 어느 농도 이상이면 세포성장에 방해물질이 된다. 반면 갈락토오즈가 탄소원으로 사용될 경우에는 에탄올의 생성은 적으나 유전자 발현으로 인한 플라스미드의 손실이 있게 된다. 여러 탄소원의 사용과 플라스미드의 불안정성, 그리고 에탄올에 의한 저해효과등은 모델의 복잡성을 가져 와 정확한 모델수립을 어렵게 한다.

이 론

재조합 균주는 크게 plasmid-harboring cell과 plasmid-free cell로 나누어 생각할 수 있다. 갈락토오즈같은 유도물질이 탄소원으로 사용되어 유전자가 발현하기 시작하면 점차로 두 균체사이의 성장속도차이, 그리고 세포분열시에 생기는 플라스미드 손실로 안정성은 점차로 떨어지게 된다. 이러한 성장기작을 나타내기 위하여 다음과 균체성장모델을 가정하였다.

[eqn: {dX^+} over {dt} ~=~ mu^+ (1-phi)X^+]	(1)

[eqn: {dX^-} over {dt} ~=~ mu^- X^- ``+`` phi mu^+ X^+]	(2)

위의 식에서, X+는 plasmid-harboring cell, X-는 plasmid-free cell이고, □는 플라스미드 손실 빈도이다.

일반적으로 미생물들은 여러 가지의 탄소원이 존재할 경우 한가지 탄소원만을 선호하며, 다른 탄소원은 선호하는 탄소원이 거의 다 소모된 이후에 소비되기 시작한다. 본 연구에서 사용되는 탄소원인 갈락토오즈와 에탄올 중 발효초기에는 갈락토오즈만이 균체에 의해 섭취되고, 갈락토오즈가 고갈되면 균체는 배양액 내에 남아 있는 에탄올을 사용하기 시작한다. 또 에탄올이 배양액 내에 과량으로 남아 있으면 균체의 성장은 저해받게 된다.

[eqn: mu~=~mu_Gal ``+`` mu_EtOH]	(3)

[eqn: mu_Gal ~=~ {mu_MAX G} over {K_Gal + G} (1 - E over E_m )]	(4)

[eqn: mu_EtOH ~=~ {mu_E_MAX E} over {K_EtOH + E + E^2 over k_i} 1 over {1 + G over k_R}]	(5)

균체 수율은 실제로 배양중 일정한 값을 가지지 않으나, 모델링의 편의성을 위해 일정하다고 가정하고 물질 수지식으로부터 다음과 같은 기질소비식을 얻을 수 있다.

[eqn: dG over dt ``=`` - 1 over { {Y }`_{Gal } ^{+ } }{mu}`_{Gal} ^+ X^+ - 1 over { {Y }`_{Gal } ^{- } }{mu}`_{Gal} ^- X^-]	(6)

[eqn: dE over dt ``=`` - 1 over { {Y }`_{E } ^{+ } }{mu}`_{E} ^+ X^+ - 1 over { {Y }`_{E } ^{- } }{mu}`_{E} ^- X^-]	(7)

실 험

본실험에서 사용한 균주는 S. cerevisiae 2102(Mat □, ura3-52, leu2-3, -112, his 4-519, suc2-□9)로 uracil 요구성이며, 단백질 분해효소 결손변이주이다. 이 균주가 가지고 있는 재조합 플라스미드는 Kluveromyces marxianus var. marxianus Y-610의 inulinase 유전자가 클로닝된 pYI11이다. 배지조성은 갈락토오즈를 탄소원으로 할 때는 YPG(yeast extract 1%, bacto peptone 2%, galactose 2%) 배지를 사용하였고, 에탄올의 효과를 알아보기 위한 실험에서는 YPDG(yeast extract 1%, bacto peptone 2%, dextrose+galactose 2%)배지나, YPG배지에 필요에 따라 에탄올을 첨가하여 사용하였다. 세포배양온도는 30℃로 일정하게 유지하였으며 5리터 jar fermentor에서 pH 5.5, 200 rpm, 1vvm의 폭기속도로 조업하였다. 샘플링 간격은 1~3시간 간격으로 하였다.

결과 및 토론

갈락토오즈만을 탄소원으로 사용할 경우, 배양 초기부터 유전자 발현이 이루어지므로 플라스미드의 손실이 심각하여 플라스미드를 갖는 균주의 분율이 배양말기에는 32% 정도밖에 되지 않았다. 식 (1)과 (2)를 더하면 아래와 같은 전체 세포농도에 대한 미분방정식이 나온다.

[eqn: {d(X^+ + X^- )} over dt ~=~ mu^+ X^+ ``+`` mu^- X^-]	(8)

겉보기 비성장속도를 □app=(□+X++□-X-)/(X++X-)라 할 때, □app는 X+, X-분율이 변함에도 불구하고 거의 일정한 것으로 관찰되었다. 이는 □+, □-가 거의 비슷한 것으로 해석된다. 따라서 플라스미드 불안정성은 두 균체사이의 성장속도 차이보다는 세포 분열시 플라스미드를 잃어버리기 때문에 나타나는 현상임을 알 수 있었다.

플라스미드 손실 빈도(□)는 그림 2에 나와 있듯이 초기에는 작다가 갈락토오즈가 활발히 사용되어 유전자가 발현할 때는 커진다는 걸 알 수 있다. 따라서 □를 상수가 아니라 갈락토오즈 소비 속도에 대한 함수로 나타내었다.

[eqn: phi~=~ {{phi(- dG over {X^+ dt}})} over {K``+``(- dG over {X^+ dt}) }]	(8)

갈락토오즈와 에탄올이 발효조내에 동시에 존재할 때, 에탄올 소비는 갈락토오즈에 의해 억제되었다. 갈락토오즈가 소모되다 어느 농도 이하가 되면 갈락토오즈와 에탄올은 효모에 의해 동시에 소모되었다. 에탄올 농도가 어느 이상이 되면 갈락토오즈 소비는 중단되었고, 균체성장도 따라서 중단되었다.

에탄올만의 영향을 살펴 보기 위해 에탄올만을 탄소원으로 하는 실험을 수행하였다. 그림 3에서 나오듯이 에탄올은 균체성장에서 탄소원인 동시에 저해제로서 작용한다. 에탄올에 의한 비성장속도는 갈락토오즈보다 느렸으나, 균체수율은 더 높았다.

모델 매개변수 계산은 실험결과로부터 eye-bowling 방법과 유전 알고리듬으로 구하였다.

참고 문헌

1. Lee, Sun Bok, Alex Seressiotis and James E. Bailey, Biotechnol. bioeng., 27, 1699(1985).

2. Yuan, Shi, Dewey D. Y. Ryu, and Wei-Kang Yuan, Biotechnol. bioeng., 25, 55(1993).

3. Lin, Chang-Shing, PhD. thesis, University of California, Irvine(1992)

Fig.1 Batch Fermentation	Fig.2 Cell growth of plasmid-harboring

(Galactose-only medium)	cell in galactose-only medium

Fig.3 Effect of ethanol conc.	Fig.4 Batch fermentation

on cell growth	(X+0: 1.87g/L, X-0: 0.32g/L

G0: 11.32g/L, E0: 13.46g/L)