E. coli □-galactosidase 전세포 효소 고정화 캡슐  개발

오 창 엽, 박 중 곤

경북대학교 공과대학 화학공학과

Preparation of Encapsulated Whole Cell Enzyme □-galactosidase

using Escherichia coli.

Chang Yub Oh and Joong Kon Park

Department of Chemical Engineering, Kyungpook National University, Tague.

서  론

효소는 금속 촉매보다 일반적으로 우수한 촉매능력을 가진 고도로 특수화된 단백질로서, 효소 촉매를 이용한 공정이 많이 개발되어 왔다. 특히 고정화 하지 않고 효소자체를 공정에 적용할 때 나타나는 단점을 보완하며, 재사용 및 회수율을 높이기 위해 효소를 고정화하는 방법이 많이 연구되어져 왔다. 그러나 효소 자체를 고정화 할 경우 효소 추출시 오염 및 과정의 복잡함, 전체 효소 생산가격의 90%를 차지하는 정제비, 효소의 크기로 인한 고정화의 복잡성 및 실활, 효소반응에 필수요소인 cofactor과 coenzyme의 부가적인 첨가, 그리고 고정화 후 재활성의 불가능등과 같은 단점으로 인하여 현재 고정화 whole cell enzyme공정의 개발이 많이 진행되어지고 있다.(1-4)

여러 가지 미생물고정화법중에서 bead내부에 entrap하는 방법이 가장 보편적으로 사용되고 있다. 그러나 bead내부에 entrap할 경우 bead를 구성하는 고분자 물질의 기계적 강도 때문에 미생물을 부피비로 25%이상 고정화시킬 수 없는 단점이 있다(5). 또한 bead내에 미생물을 고정화배양하는 경우 미생물이 bead밖으로 새어나오며 bead내부에서의 물질 및 산소전달 문제로 인하여 bead내부에 미생물이 성장하지 못하는 영역이 생기게 되는 문제점이 있다. 이에 반하여 캡슐의 경우 미생물을 고정화할 수 있는 내부공간이 매우 넓으며 캡슐막에 의한 물질전달저항이 상대적으로 작기 때문에 최근 encapsulated whole cell enzyme법이 많이 연구되고 있다(6-9). L-lysin을 생산하는 C. glutamicum을 캡슐 고정화하여 배양하는 경우 배지조성에 따라 캡슐내부 건조중량이 200g/L에 달하였으며(7), invertase를 생산하는 S. cerevisia의 캡슐 고정화(8) 및 □-galactosidase를 생산하는 E. coli의 캡슐고정화법이 성공적으로 수행되었다(9). 그러나 이는 초기연구단계로서 encapsulation하였을 때 캡슐막에 의한 효소활성의 영향 및 특성은 밝혀져 있지 않다.

본 연구에서는 근래에 유제품 공정의 부산물에 의한 환경오염 방지 및 lactose를 분해할 경우 나타나는 많은 장점 때문에 이용가치가 높아지고 있는 □-galactosidase를 생산하는 E. coli를 담체내의 배양에서와는 달리 캡슐 내부에 고정화배양 시킨 전세포 효소 고정화 캡슐을 개발하고 캡슐 전세포 고정화 효소의 특성을 밝히고자 한다. 이를 위하여 먼저 캡슐내부에 고농도의 cell배양을 위한 최적 조건을 조사하며, 이러한 조건에 따라 생산된 효소의 활성도를 조사하고 캡슐막의 존재에 따른 효소 반응속도에 대한 영향을 검토하고자 한다. 또한 고정화된 전세포 효소의 재사용 여부를 조사하고자 한다.

재료 및 방법

본 실험에 사용된 균주는 Escherichia coli (KCTC 1116)이며 배지조성은 Table 1과 같다.

미생물고정화 및 배양은 먼저 CaCl2용액(1.3%(w/v))에 계대배양한 cell 용액 20ml를 원심분리하여 상등액을 제거한후 혼합하여 적당히 교반되고 있는 sodium alginate용액(0.6%(w/v))에 방울 방울 떨어뜨림으로서 미생물이 고정화된 완전구형인 직경 2mm이하의 캡슐을 제조할 수 있었으며(6), 제조된 캡슐을 HEPES buffer(pH7.2)에 10분간 수축시킨 후 성장배지 및 생산배지에서 연속적으로 배양하였다. 배양된 cell의 캡슐내부 건조중량은 미생물이 고정화되어 배양된 캡슐과 미생물이 고정화되지 않은 캡슐을 80℃ oven에서 3일 이상 무게가 변하지 않을 때까지  건조시킨 후 무게의 차로서 결정하였다.

□-galactosidase의 활성도는 Lederberg(10)의 방법에서 buffer용액만 imidazole buffer (pH7.0)로 대체하여 사용 및 측정하였다. 즉 O.N.P.G.(o-nitrophenyl-□-

galactopyranoside)를 5mM이 되도록 imidazole buffer(pH7.0)용액에 용해한 다음 기질용액을 37℃로 온도조정한 후 whole cell enzyme이 고정화된 캡슐을 첨가하여 150rpm으로 교반하면서 반응시켰다. 반응정지액은 Na2CO3 (1M) 용액을 사용하였다. 황색으로 발색된 기질용액을 UV-VIS spectrophotometer(Shimadazu 1201)를 사용하여 파장 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성 UNIT는 □mol/min이다.

효소활성에 대한 캡슐막의 영향을 검토하기 위해 캡슐막을 용해한 것과 용해하지 않은 것으로 효소 활성을 측정하여 비교하였다. 캡슐막을 용해하기 위하여 Na-phosphate buffer(pH7.0)을 사용하였다.

Table 1. Composition of growth(9) and production medium

Composition	Growth medium L-1	Production medium L-1
Glucose	20 g
Lactose		10 g
Yeast extract	10 g	2 g
Tryptone	10 g
NaCl	10 g
Beef extract		5 g
Peptone		5 g
CaCl2	10 g	10 g

※ CaCl2 는 배양중 캡슐의 용해를 방지하기 위해 첨가

결과 및 고찰

본 실험에서는 batch culture에서 1시간 단위로 pH를 보정한 경우와 보정하지 않은 경우에 대해 먼저 free cell을 성장배지에서 배양한 후 cell농도를 비교하였고 다음으로 encapsulated whole cell을 성장배지에서 배양한 후 캡슐내부에 축적되는 cell의 농도를 비교하였다. Table 2에서 볼수 있듯이 pH가 보정된 경우, Free cell 배양에서는 cell 농도가 280%정도 증가했으나 Encapsulated cell 배양에서는 캡슐내부에 cell의 농도가 약 40%감소함을 알수 있으며, 또한 캡슐 외부의 배양액중에 cell의 농도가 100%정도 증가함을 알수 있었다. 이러한 현상은 캡슐내부에 고정화 배양시 cell의 생산물들에 의해 캡슐외부보다 캡슐내부가 상대적으로 더 나쁜 성장조건을 형성하게 되므로 cell이 캡슐 외부로 새어나오게 되고, 또한 pH를 보정하지 않은것보다 pH를 보정해 줌으로써 캡슐 외부에서 cell의 성장이 증가하고 동시에 캡슐내부로 확산되는 영양분의 양이 줄어들게 되므로 pH를 보정하지 않은 경우에 캡슐내부에 더 많은 양의 cell을 축적 및 배양할 수 있다고 판단된다.

성장배지내의 탄소원인 glucose농도를 변화함에 따른 캡슐에 고정화된 cell의 성장 및 효소의 활성을 비교하였다. 그 결과 glucose의 농도가 20g/L일때 캡슐내부에 축적되는 cell의 농도와 효소의 활성도가 가장 높았다. 그러나 생산배지의 yeast extract의 농도를 변화시킨 결과에서는 농도의 변화에 따른 성장량과 효소의 활성도의 변화는 없는 것으로 나타났다.

본 실험에서는 □-galactosidase생산의 유도 물질이며, 탄소원인 lactose를 생산배지에 첨가하여 사용하였다. lactose의 농도의 변화에 따른 cell의 성장과 생산된 효소의 활성도을 조사 하였다. 실험은 Free cell배양의 경우와 캡슐내부에 고정화 배양한 경우로 구분하여 실시 했으며, 그 결과는 Fig. 1.과 Fig. 2.에서 볼수 있다. 두가지 경우 모두 lactose의 농도가 증가함으로써 cell의 농도는 증가하나 효소의 비활성도는 감소하는 것을 알수 있다. 또한 lactose의 농도가 10g/L일 때 가장 높은 비활성도를 나타내었다. 그러나 Free cell 배양에서는 lactose 농도의 증가에 따라 효소의 비활성도가 최대 70%까지 감소하였으며, 캡슐에 고정화된 경우에서는 40%정도 감소한 것으로 나타났다. 이것은 캡슐막의 확산저항에 의하여 실질적으로 캡슐내부에 존재하는 cell은 배지용액에 존재하는 lactose의 농도보다 낮은 농도의 영향을 받으므로 상대적으로 비활성도가 더 커진 것으로 판단된다.

본 실험에서는 캡슐막에 의한 효소반응속도의 영향을 검토하였다. 각각의 3, 5. 7, 10, 15, 20mM의 ONPG용액에 캡슐막이 용해된 whole cell enzyme과 캡슐막이 용해되지 않은 encapsulated whole cell enzyme를 첨가하여 효소반응속도를 측정하였다. 그 결과는 Fig. 3.과 Fig 4에 나타나 있다. Fig 4 와 같이 Lineweaver -Burk plot을 사용하여 계산된 각각의 M-M 효소반응속도 상수값은 캡슐막이 존재하지 않는 경우 와 캡슐막이 존재하는 경우 각각 Km : 15.64mM, Vmax : 0.046mM/min 와 Km : 44.86mM, Vm : 0.048mM/min을 나타내었다. 효소의 양을 나타내는 Vm값은 거의 같았으나 Km값은 캡슐막이 존재할 경우 약 3배 증가하는 것으로 보아 캡슐막에 의한 확산저항이 심각함을 보여주었다.

Encapsulated whole cell enzyme을 10일 동안 재사용한 결과 캡슐막의 swelling현상만 약간 나타났으나 용해는 없었다. 재사용시 효소의 활성도는 4일 후부터 겉보기 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 이것은 막의 swelling으로 인하여 상대적으로 캡슐막에 의한 확산저항의 감소된 것으로 판단된다.

Table 2. Cell concentration of free and encapsulated cell batch culture.

구 분		배 양 시 간 (hour)	Cell 농도 (g Dry cell weight / L)
			pH 보정	pH 미 보정
Encapsulated cell culture	In capsule	15	34 g/L	54 g/L
	In bulk medium	15	3.05 g/L	1.47 g/L
Free cell culure		10	4.13 g/L	1.48 g/L

참고문헌

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2. B. Champluvier, B. Kamp and P. G. Rouxhet, Enzyme Microb. Technol.,

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6. S.H. Cheoung, J.K. Park, B.S. Kim and H.N. Chang, Biotechnology

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7. S.H. Cheong, T.J. Lee, J.K. Park and H.N. Chang, Kor. J. Biotechnol.

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9. B.H. Lee and J.K. Park, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 11, 4 398-404, (1996)

10. J. Lederberg, J. Bacteriol. 60, 381-392, (1950)