Beauveria sp.의 균사체 배양을 위한 생산배지의 최적화

문기혁*, 김병혁, 윤정원*, 성재모**, 김승욱

고려대학교 화학공학과, 수원대학교 유전공학과*, 강원대학교 농생물학과**

Optimization of Production Media for Mycelial Culture of Beauveria sp.

Ki-Hyok Moon*, Pyong-Hyok Kim,  Jeong-Weon Yoon*, Jae-Mo Sung**, Seung-Wook Kim

Department of Chemical Engineering, Korea University

Department of Genetic Engineering, Suwon University*

Department of Agricultural Biology, Kangweon National University**

서 론

미생물을 이용한 살충 수단은 최근의 새로운 개념이 아니며, 이미 오래전부터 상업적 생산이 시작된 것들이다. 대표적으로는 Bacillus thuringiensis(Bt)를 들수 있으며, Bt 유전자를 식물 유전자에 형질전환 시키는 노력과 함께 아직도 Bt에  관한 많은 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 이와 함께 곤충 병원성 곰팡이를 이용한 해충 방제도 매우 강력하고 유용한 수단이므로 이에 대한 관심이 고조되고 있으나 아직 국내에서는 그 연구정도가 미미한 상태이다.

불완전균류인 Beauveria, Metarhizium, 그리고 Aspergillus등은 자연 상태에서 자주 접할 수 있는 균주이므로 미생물 생산을 위하여 많은 연구가 시도되고 있다. 특히 Beauveria sp.와 Metarhizium sp.는 가장 넓은 숙주범위를 가지고 있고, 지난 20여년 간 지속적으로 연구되어 왔으나, 아직도 곤충 기생균을 미생물 살충제로써 산업적 단계의 수준으로 사용하기에는 해결해야 하는 많은 문제점들이 있다. 가장 중요한 문제는 강한 살충성을 유지하면서 대량 배양을 하는 것인데, 세포의 고농도 배양을 위해서는 다양한 첨가제 등의 기질을 선택하여야 할 뿐만아니라 온도와 pH도 성장에 알맞는 범위를 설정해 주어야 한다.

본 연구에서는 곤충 기생균을 미생물 살충제로 산업화에 이용하기 위해서는 대량배양기술을 확립하여야 하는데, 가장 넓은 숙주 범위를 가지고 있는 Beauveria sp.를 선정하여 성장 조건을 확립하고, 이들 균주를 다양한 기질의 탄소원과 질소원, 무기염류 등을 이용하여 배양한 후 균체량, 효소의 역가 그리고 포자의 농도를 측정하여 산업적 이용이 가능한 적정배지를 선별함에 그 목적이 있다.

실험재료 및 방법

곤충 병원성 곰팡이의 일종인 Beauveria sp. C208을 강원대학교 농생물학과로부터 분양받아서 본 실험에서 사용하였다. 균주보관시 사용한 사면배지는 DPA(dextrose 2%, peptone 1%, agar 1.5%)배지를 사용하였고, 종균배지로는 DPA배지에서 agar를 제거한 액상배지를 사용하였다. 대상균주의 성장곡선 측정과 다양한 기질의 영향을 조사하는 삼각 플라스크에서의 액체배양은 250□ 삼각플라스크에 조업부피가 100□가 되도록 액체배지를 만들어서 28℃, 180rpm으로 진탕배양 하였다. 살충성 확인을 위한 시험용 배지로는 chitinase확인을 위해서 collidal chitin 0.6%, MgSO4.7H2O 0.05%, KH2PO4 0.03%, K2HPO4 0.07% FeSO4.7H2O 0.001%, ZnSO4.7H2O 0.0001%, MnCl2 0.0001%, 그리고 agar 1.5%를 혼합하여 만들었으며, protease확인 배지로는 dextrose 1%와 skim milk(서울탈지분유-단백질 35% 함유) 1% 그리고 agar 1.5%를 혼합하여 만들었다. lipase의 확인 배지는 tributyrin (Sigma Co.) 1% 그리고 agar 1.5%를 잘 혼합하여 충분히 녹여준 후 homogenizer를 이용하여 유화시켜서 만들었다. 모든 배지는 121℃, 15기압에서 15분간 멸균해서 1회용 petri dish에 4□의 두께로 분주하여 사용하였다.

Chitinase, protease, 그리고 lipase 측정용 배지 위에 멸균한 paperdisk (ADVANTEC, 8□, thin, Toyo Co.)를 올려놓고, 배양물을 20□씩 접종하여 28℃에서 배양한 후, 각 배지 위의 halo의 직경을 2일째와 4일째 두 번 측정하여 살충성의 정도를 간접적으로 확인하였다. 균체량 측정은 dry weight와 PMV를 사용하여 측정하였고, 포자 농도를 측정하기 위해 혈구계수기를 이용하여 배양물내의 포자농도를 측정하였다. 각기 다른 다양한 탄소원, 질소원, 무기염류등이 균체의 성장 및 효소역가, 그리고 포자의 생성능력에 미치는 영향을 조사하였다.

결과 및 고찰

Beauveria sp. C208은 PDA와 SDA배지에서 균체량은 큰 차이 없이 성장하는 것을 관찰할 수 있었으나, 자라는 형태와 포자의 생성 정도는 배지의 종류에 따라 차이가 있었다. Beauveria sp. C208은 PDA배지에서 더 좋은 성장을 보이며, 배양 온도 25℃와 28℃에서는 큰 성장차이를 보이지 않았다. 배지에 따른 영향은 PDA배지에서는 포자의 생산이 더욱 활발하였으며, SDA배지에서는 균체량의 증식이 더욱 좋았다. 이러한 결과는 농도가 높아서 충분한 영양분이 공급되기 때문인 것으로 추정되었다. 각기 다른 탄소원을 사용하여 배양한 결과, 볏짚에서 Beauveria sp. C208의 균체량이 3%로 좋았으며, 이때 효소의 활성도가 다른 기질에 비해서 3개의 효소 활성이 모두 우수하게 나타났고, 포자의 농도도 1.96×108으로 나타나서 선정하였다(Table 1). Beauveria sp. C208은 모든 기질에서 pellet이 아닌 배지 전체에 고루 퍼져서 자랐으며, 특이한 사항은 saw dust와 corn starch에서는 foam이 매우 많이 발생하였고, foam에는 포자가 많이 있었다. 균체량은 rice straw, 술찌끼 건조물, rice bran, molasses, wheat flour 그리고 yellow sugar등이 많이 증식했으며, 균체량이 증가하면 포자의 농도도 증가함을 관찰할 수 있었다. 그러나 균체량과 효소의 활성도와는 무관하였다. 효소의 활성도는 기질의 종류와 연관이 있었다. Dextrose와 sucrose는 거의 성장이 미비하였으며, 포자의 농도도 적었으며, lactic acid와 citric acid도 탄소원으로는 부적절하였다. 이들중 탄소원으로 rice straw와 molasses를 선정하여 최적 농도를 측정한 결과 rice straw 2%가 결정되었다(Table 2). 균체량, 효소 활성도, 포자의 생성능 등이 가장 우수하였고, 당밀의 경우 효소의 활성도가 너무 낮게 나타나서 탄소원으로 사용하기에는 부적합하였다.

무기 질소원의 영향을 조사한 결과, 무기 질소원은 균체량 증가 및 포자 생산에 크게 도움이 되지 않는 것을 알 수 있었다. 무기 질소원과는 달리 유기 질소원은 균체량 및 포자 형성에 대부분 좋은 영향을 주었다. Beauveria sp. C208은 전반적으로 배양 조건 상태 차이로 추정되는 이유 때문에 균주의 성장이 탄소원 선별 배양 때보다 못하였으나 tryptone을 사용한 경우가 7.67%를 나타내어서 탄소원의 선별 때와 같은 조건인 bacto-peptone을 사용할 때의 1.37%보다 크게 증가하였음을 관찰할 수 있었다(Table 3). 유기 질소원 중에서 전반적으로 우수하게 나타난 tryptone과 hydrolyzed casein의 농도별 영향을 조사하였다. 그러나 tryptone과 hydrolyzed casein은 산업적 배지로 사용하기에 너무 고가의 배지이어서 값싼 기질이면서 다소 좋은 효과를 나타낸 술찌끼 건조물도 함께 농도를 조사하였다. Beauveria sp. C208은 Table 4에 나타났듯이 tryptone 0.6%가 가장 적합한 농도로 결정되었다. 술찌끼 건조물은 tryptone에 비해서 균체량 및 효소의 역가 등이 낮게 나타나서 적합하지 못하였다.

선정된 탄소원과 질소원의 최적 농도를 기본 배지로 하여 각종 무기 염류들을 첨가하여 그 영향을 관찰하였다. Beauveria sp. C208에는 무기염류가 오히려 성장을 방해하는 것으로 나타났다. 배양 상태를 보면 Tween 80, magnesium chloride, potassium chloride 등과 함께 magnesium sulfate가 배양물에서 점도를 나타낼 정도로 성장이 좋았으며, 6.67g/□의 가장 높은 건조 중량을 보였으나, 이 결과는 대조구에 비해서는 오히려 2.0g/□이나 낮은 성장률을 보였다. 때문에 각종 무기 염류들이 C208의 성장에는 별 도움을 주지 못하는 것으로 판단한다. 무기 염류 등을 첨가하여 가장 좋은 결과가 나왔던 magnesium sulfate를 농도별로 시험 배양해 본 결과도 마찬가지로 대조구에서 더 높은 건조중량을 보였다. Cupric chloride는 배양 결과 오히려 균의 성장과 함께 효소 생산 등을 저해하는 것으로 나타났다.

감사

본 연구는 농림수산부의 농림수산특정연구 과제로 수행되었으며 이에 감사드립  니다.

참고문헌

1. D.W. Roberts and W.G. Yendal, In Microbial control of insects and mites.       H.D. Burges and N.W. Hussey, Eds. Academic Press. New York, 125-149.

2. D. Moore and C. Prior, Biocontrol News and Inform. 14, 31N-40N(1993).

3. D.J. Im, M.H.R.M. Aguda, and M.C. Rombach, Kor. J. Appl. Entomol. 27(1),      41-46(1994).

4. M.G. Ferry, T.J. Poprawski, and G.G Khachatourians, Biocontrol Science and     Technol. 4, 3-34(1994).

Table 1. Effect of various carbon sources on cell mass, enzyme activity and sporulation in cultivation of Beauveria sp. C208

Carbon substrate	Cell mass	Enzyme activity			Sporulation
		Chitinase	Protease	Lipase
* rice straw	3	++	++	++	1.96 ×108 /ml
* saw dust	ND	++	+	+++	9.32 ×107 /ml
* rice bran	ND	+	-	++	2.96 ×108 /ml
* wheat flour	3	++	-	+	4.28 ×107 /ml
* corn starch	2	++	-	++	2.95 ×108 /ml
dextrose	1.17	++	-	++	2.75 ×107 /ml
lactic acid	1.41	+	-	++	5.50 ×107 /ml
citric acid	1.63	+	-	++	1.81 ×107 /ml
sucrose	0.9	++	+	++	3.72 ×107 /ml
molasses	5.51	++	-	+++	2.63 ×108 /ml
distiller's dry solubles	4	+	-	++	6.51 ×108 /ml
yellow sugar	3.81	++	-	++	8.32 ×107 /ml

Culture was carried out at 28℃ in the basal medium containing1.0% (w/v) carbon source.

+ and - mean halo size (-; 0□, +; ≤1□, ++; ≤1.5□, ++; ≤2.0□, +++;≤2.5□, +++;≤3.0□, ++++; ≤3.5□, ++++; ≤4.0□)

ND : Not determined

* : Insoluble substrate. Cell mass was measured by Packed Mycelium Volume (PMV).

Table 2. Effect of the concentration of rice straw on cell mass, enzyme activity and sporulation in cultivation of Beauveria sp. C208

Rice straw	Cell mass	Enzyme activity			Sporulation
		Chitinase	Protease	Lipase
* 1%(w/v)	3.17	-	++	+++	3.01 × 108 /ml
* 2%(w/v)	7	-	++	++	3.80 × 108 /ml
* 3%(w/v)	8.17	-	+	++	1.44 × 108 /ml
* 4%(w/v)	4.83	-	++	++	1.50 × 108 /ml

Culture was carried out at 28℃ in the basal medium.

+ and - mean halo size (-; 0□, +; ≤1□, ++; ≤1.5□, ++; ≤2.0□, +++;≤2.5□, +++;≤3.0□, ++++; ≤3.5□, ++++; ≤4.0□)

* : Insoluble substrate. Cell mass was measured by Packed Mycelium Volume (PMV).

Table 3. Effect of organic nitrogen sources on cell mass, enzyme activity and sporulation in cultivation of Beauveria sp. C208

*Organic nitrogen	Cell mass	Enzyme activity			Sporulation
		Chitinase	Protease	Lipase
soybean meal	2.2	-	-	++	7.16 × 107 /ml
corn steep liquor	4.97	-	-	-	2.43 × 108 /ml
proteose peptone	0.97	-	++	++	4.80 × 106 /ml
bacto-peptone	1.37	-	++	-	2.19 × 108 /ml
tryptone	7.67	-	-	-	1.57 × 108 /ml
yeast extract	2.97	-	+	+	1.60 × 108 /ml
hydrolyzed casein	2.37	-	-	+	2.37 × 108 /ml
distiller's dry solubles	1.97	-	+	-	2.28 × 108 /ml

Culture was carried out at 28℃ in the basal medium containing 1.0% (w/v) organic nitrogen source.

+ and - mean halo size (-; 0□, +; ≤1□, ++; ≤1.5□, ++; ≤2.0□, +++;≤2.5□, +++;≤3.0□, ++++; ≤3.5□, ++++; ≤4.0□)

ND : Not determined

* : Insoluble substrate. Cell mass was measured by Packed Mycelium Volume (PMV).

Table 4. Effect of the concentration of trypton on cell mass, enzyme activity and sporulation in cultivation of Beauveria sp. C208

*Tryptone	Cell mass	Enzyme activity			Sporulation
		Chitinase	Protease	Lipase
0.2%(w/v)	3.67	-	+++	++	3.49 × 108 /ml
0.4%(w/v)	1.34	-	+++	++	2.70 × 108 /ml
0.6%(w/v)	6.00	-	+++	++	2.56 × 108 /ml
0.8%(w/v)	2.50	-	+++	++	1.39 × 108 /ml
1.0%(w/v)	5.00	-	+++	+++	2.58 × 108 /ml

Culture was carried out at 28℃ in rice straw 2%(w/v) medium containing different trypton conc.

+ and - mean halo size (-; 0□, +; ≤1□, ++; ≤1.5□, ++; ≤2.0□, +++;≤2.5□, +++;≤3.0□, ++++; ≤3.5□, ++++; ≤4.0□)

ND : Not determined

* : Insoluble substrate. Cell mass was measured by Packed Mycelium Volume (PMV).