나일론 캡슐제조 조건이 GOD고정화 합성이분자막 마이크로캡슐의 효소 활성에 미치는 영향에 관한 연구

김정란(학) 변인섭(학), 김운수(학), 김용욱(정)

경희대학교 화학공학과

A study of effect on enzymatic activity of GOD immobilized synthetic bilayer capsule with preparation condition of nylon capsule

Jung-Ran Kim, In-Seop Byun, Woon-Soo Kim and Yong-Wook Kim

Dept. of Chem Eng., Kyung Hee University

서론

효소는 단백질의 일종으로, 동물, 식물, 미생물 등의 생세포에서 생성되는데 생화학 반응의 촉매역할을 한다. 효소는 상온[eqn: CDOT]상압에서 반응이 가능하고 특정기질과 선택적으로 반응을 일으키는 특성으로 산업적으로 많이 이용되고 있다.(1)

그러나 효소는 효소반응 자체가 수용액 상태에서 진행되기 때문에 반응완료 후 생성물과 효소의 분리가 곤란하여 효소를 재 사용할 수 없다는 단점을 가지고 있다.(2)

이 때문에 간단한 단위조작으로 효소활성을 유지하면서 반응액으로부터 효소를 분리할 수 있는 효소 고정화법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.(3)

여러 가지 효소고정화 방법중, 합성이중막을 이용한 microcapsule법은 효소분자를 반투과성막으로 포괄하여 효소의 분산을 막고, 원하는 반응조건에서 효소반응을 일으키는 방법이다.

본 연구에서는 microcapsule법을 이용하여 GOD(Glucose Oxidase)를 고정화한 합성이분자막을 제조하였다. GOD고정화캡슐의 초기단계에서 제조되는 나일론 막의 제조에 있어서 벽재물질의 주입소도, 가교제 변화 등이 최종적으로 제조된 microcapsule에 고정화된 GOD의 온도, pH의 변화에 대한 활성에 미치는 영향을 고찰하고 이에 따른 효소반응 속도론에 관한 연구를 실시하였다.

이론

1. GOD가 고정화된 합성 이분자막 제조

본 연구에 사용된 합성이분자막은 GOD가 고정화된 나일론 막에 양쪽 친매성 물질(bilayer-forming amphiphiles)을 피복 시켜 얻어지는데 나일론 막의 제조 조건에 따라 그 특성이 달라져 GOD활성에 중요 변수가 된다.

나일론 막은 벽재 물질인 ethylenediamine을 terephaloyl chloride와 계면중합을 시켜 얻어지는 poly(ethyleneterephthalamide)막이라 말하는데 그 반응식은 다음과 같다.

H2N(CH2)2NH2 + CLCOC6H4COCL ――→ ―[―NH(CH2)2NHCOC6H4CO―]n―  (1)

일반적으로 poly(ethyleneterephthalamide)는 선형고분자로 분자량이 증가하여 chain의 길이가 길어질수록 강도가 떨어지는 단점이 있기 때문에 가교제로 trimesoyl chloride를 첨가함으로써 3차원 망사구조로 만들면 물리적으로 강한 다공질의 나일론 막이 얻어진다.(4)

이렇게 제조된 나일론 막에 GOD를 투석시킨 후 양쪽 친매성 물질과 반응시키면 나일론 막의 세공에 양쪽 친매성 물질이 피복되어 최종적으로 pH, 온도 자극성 합성이분자막이 제조된다.

2. GOD 활성 측정

합성이분자막에 고정화된 GOD의 활성은 GOD가 Glucose와 반응하여 생성되는 gluconic acid가 용액중에서 해리될 때 생성되는 수소이온의 농도변화를 측정하면 알수 있는데, 이것을 반응식으로 나타내면 다음과 같다.

GOD

C6H12O6 + O2 + H2O ――――→ C6H12O7 + H2O2        (2)

저 분자량의 기질 glucose는 합성이중막이 반응이 일어날 수 있는 온도 및 pH에 도달하면 합성이분자막을 자유롭게 투과하여 GOD와 반응하여 gluconic acid와 H2O2생성한다. gluconic acid는 나일론 막 안팎의 농도 차에 의해 캡슐 밖으로 방출되고 캡슐내부에는 GOD만 존재하게 되며, 이를 도식적으로 나타내며 Fig.1 과 같다.

따라서 GOD활성의 반응속도 연구는 glucose acid가 이온화되면서 나타나는 수소이온 농도의 변화를 측정하여 Michaelis - Menten Kinetics로  나타낼 수 있다.(4)

실험

GOD 고정화 합성이분자막 마이크로캡슐의 제조는 먼저 나일론 막을 적하법으로 계면중합에 의해 제조한 후 GOD를 고정화시키고, 이것을 다시 양쪽친매성물질로 피복시켜 제조하였다.

1) GOD고정화 합성이분자막 마이크로갭슐 제조

수산화나트륨과 ethylenediamine을 혼합한 용액을 상온에서 syringe pump로terephaloyl chloride, trimesoyl chloride,chloroform과 cyclohexane을 혼합용액이 들어있는 반응기내에 적하하여 나일론캡슐을 제조하였다. 이렇게 제조된 나일론 캡슐을 GOD를 고정화 시키기위해 glutaraldehyde용액으로 처리하여 glutaraldehyd의 농도를 변화 시켜 반응시킨 후 GOD를 투석시켰다. GOD가 고정화된 나일론 캡슐의 표면을 양쪽 양쪽친매성물질이 용해된 dodecane용액으로 피복시켜 최종적으로 합성이분자막 캡슐을 제조하였다.

Fig. 1 Reaction mechanism of immobilized GOD in a microcapsule of synthetic          amphiphilie bilayer

2) GOD 활성 측정

효소 활성장치로 온도 조절기가 설치된 항온조내에 분리형 3구 플라스크 반응 기를 설치하여 활성측정 실험을 하였다.

이때 반응기 내부에 교반기를 사용하여 캡슐 주위의 농도분극이나 경막저항을 제거하였다. 반응기 기질용액의 pH는 적당량의 HCl과 NaOH를 첨가하여, 일정하게 조절하였으며, pH 전극에 의해 측정하였다.

결과 및 토론

Fig.2는 GOD가 고정화되기전의 나일론 캡슐의 표면을 S.E.M.(Scanning electron microscope)으로 관찰한 것이다. 이때 유기용매로 사용된 chloroform과 cyclohexane의 비는 3:1이었고 0.03 mmole의 trimesoyle chloride를 가교제로 사용하였다.

그림에서 보는 바와 같이 나일론 캡슐막은 비대칭의 다공질 구조임을 알 수 있었고, 이 다공질을 통하여 GOD가 투석된 후 양쪽친매성 물질이 피복된 후 pH,온도 자극성 합성이분자막이 되는 것으로 생각된다.

Fig. 2 Scanning electron microscope of poly(ethyleneterephthalamide) capsule

membranes(outer surface)

참고문헌

[1]. Y. Okahata, S.Hachiya, J. Polymer Sci, 22, 585-599(1984)

[2]. H.Kitano, Y.Akatsuka, N.ise, Macromolecules, 24, 42(1992)

[3]. T.Okano, Y.H.Bae, S.W.Kim, Pharmaceutical reserch, 8, 624(1991)

[4]. J.H.Kim, Y.M.Lee, C.N.Chung, Kor.J.ind.Chem.Eng., 3, 296(1992)