고농도 발효를 위한 산소농축용 기체분리 멤브레인 씨스템의 이용

이 석 재, 이 은 규, *정 경 환, *김 경 연

한양대학교 화학공학과, *(재)목암생명공학연구소 발효연구실

Use of Oxygen Enriching Gas Separation Membrane System  for

High Cell density Fermentation

Seok-Jae Lee, Eun Kyu Lee, *Kyung-Hwan Jung, *Kyung-Youn Kim

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

*Mogam Biotechnology Research Institute, Fermentation Lab

서론

본 연구에서는 재조합 Pichia pastoris를 대상으로 고농도 발효 및 발현에 필수적인 용존산소문제 해결을 목적으로 기체분리 멤브레인 시스템을 이용한 농축산소 공급을 통해 보다 효율적인 발효공정을 개발하였다.  발현대상 단백질은 효소저해제용 펩타이드 (EIP: elastase inhibitor peptide)이었다.

재료 및 방법

사용균주: 본 연구에서 사용한 Pichia pastoris GS115는 (재)목암생명공학연구소에서 제작하였다.

배지 및 배양조건: 종균배지인 YPD 배지에 균주를 접종한 후 진탕배양기에서 30℃, 200rpm로 2일간 배양한 후 5L 발효기 (B. Braun Biotech, 독일)의 접종액으로 사용하였다. 1.5L 부피의 생산배지(glycerol 40g/L, K2SO4 18g/L, MgSO4 10.24g/L, KOH 4.13g/L CaSO4 0.9g/L, H3PO4 27ml/L, NH4OH 25% 30mL)를 기본배지로 하여 30℃, pH 5.0에서 압축공기 또는 산소농축공기를 1.5-2 vvm으로 공급하였다.  Derepression과 induction을 위한 유가식 배양구간에서는 각각 glycerol과 메탄을을 DO-stat 방법으로 공급하였다.

농축산소공급장치:  이 장치는 반투과성의 고분자 멤브레인을 사용하여 압축공기를 hollow fiber내에서 농축질소와 농축산소로 분리하는 장치이다. 투과기체내 산소분압은 28-38%가 된다. 이 장치의 기초 P&ID를 Fig. 1에 나타내었다.

분석 방법: 균체농도는 600nm에서 측정한 흡광도와 건조중량을 비교하여 보정 곡선을 결정하고 이 보정 곡선으로부터 결정하였다.  메탄올 농도는 발효액을 여과후 불꽃이온검출기(FID)가 장착된 가스크로마토그래피((주)도남, DS6200)로 분석하였다.  Capillary column은 DB-1(0.25mm ID, 30cm length), injector 온도는 250℃, detector 온도는 250℃, 오븐의 온도는 150℃, 주입량 5□L, 운반기체로는 질소가 사용되었다.  발현된 효소저해제는 Jung[1] 등의 방법을 참조하여 정량분석하였다.

결과 및 토론

Pichia pastoris 발현체계를 이용한 재조합 단백질 생산[2-5]에서 중요한 요소로서 용존산소의 원활한 공급과 induction시 메탄올을 최적농도로 공급하는 것을 꼽을 수 있다. 먼저 메탄올 공급 경우 (1) 일정량을 일정시간마다 주입하는 intermittent feeding 방법과, (2) 용존산소농도와 연계시켜 주입하는 DO-stat 방식으로 공급하여 각각의 발현성능을 비교하여 보았다. Fig. 2에서 보듯이 intermittent feeding (8 ml/h) 경우 메탄올이 축적되었으며 이에 따라 EIP 발현량은 약 78 mg/L이었다. 특히 메탄올 농도 약 3% 이상에서는 거의 발현이 되지 않음을 볼 수 있었다. 반면에 DO-stat (20-50% air saturation) 경우 메탄올 농도가 0.05-0.1%로 유지되었으며 170 mg/L의 발현량을 얻게 되었다.

고농도 배양에 따른 용존산소 부족현상을 해결하기 위하여 기체분리 멤브레인 시스템을 이용한 농축산소공기 (38% 산소분압) 공급시스템을 발효조에 부착하여 발효공정 초기부터 농축산소기체를 공급하였다. 이 경우 압축공기 공급시스템을 농축산소공기 공급시스템으로 완전대체하였다. 이를 통하여 derepression과 induction시 비교적 높은 용존산소농도 (30-60% air saturation)를 유지할 수 있었다. 기존의 압축공기를 사용한 공정과 대비하여 발효 및 발현성능을 비교한 경우 Fig. 3과 4에서 보듯이 derepression 단계에서의 세포 비성장속도(□)가 0.059 h-1에서 0.082 h-1로 약 1.4배 향상되었고 이에 따라 최종세포농도(Abs@600nm)도 480에서 750으로 약 1.6배 증가되었다. 또한 induction시 EIP발현량도 180에서 205 mg/L로 약 15% 향상되었다. 하지만 세포 단위질량당 발현량(specific expression titer)는 고농도 세포배양시 오리려 감소하였으며, 최적의 메탄올 공급방법의 개발과 병행하여 specific titer를 극대화시키는 것이 필요할 것으로 사료되었다.

Induction시 EIP 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 Fig. 5에 나타내었다.

결론 및 향후 연구방향

재조합 P.pastoris 발효를 통해 EIP합성하는 발효공정에서의 산소공급 문제를 해결하기 위해 38% 농축산소공기를 생성하는 기체분리 멤브레인 시스템을 발효조에 부착하여 사용하였다. 기존의 압축공기 주입시스템이나 산소와 공기의 혼합기체 주입시스템을 완전대체하여 실험한 결과, 용존산소농도를 비교적 높게 유지함으로써 세포의 비성장속도 향상을 통해 고농도 배양을 달성하였고 EIP 발현량도 증가하였다. 향후 메탄올 feeding 방법의 최적화와 더불어 단위질량의 세포당 발현량을 극대화시키는 공정개발에 성공할 경우 이 장치는 고농도배양을 위한 새로운 산소공급방법으로서 널리 이용될 것으로 기대된다.

참고 문헌

[1] H. I. Jung, S. I. Kim, K. S. Ha, C. O. Joe, and K. W. Kang (1995), Isolation and Characterization of Guamerin, a New Human Leukocyte Elastase Inhibitor from Hirudo nipponia, J. Biol. Chem., 270(23), 13879-13884.

[2] Y. Chen, E. Komives, C. White, J. Cino, G. Hart,  and N. M. Kempi (1995), High Protein Expression Fermentation of Recombinant Pichia pastoris in a Fed-Batch Process, Annual Meeting of the American Society for Microbiology in Washington, DC, May 21-25,

[3] J. M. Cregg, T. S. Vedvick, and W. C. Raschke, (1993) Recent Advances in the Expression of Forein Genes in Pichia pastoris, Bio/Technology 11, 905-909.

[4] C. Cheng, Y. L. Huang, and S. T. Yang (1997), A Novel Feeding Strategy for Enhanced Plasmid Stability and Protein Production in Recombinant Yeast Fedbatch Fermentation, Biotech. Bioeng 56, 23-31.

[5] J. M. Cregg, J. F. Tschopp, C. Stillman, R. Siegel, M. Akong (1987), High-Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology, 5, 479-485.

M   1    2   3   4    5    6   7

16,950

14,437

6,512

3,452

1,423

Fig. 5. SDS-PAGE(16.5%) stained with

Coomasie blue

M. Standard Mark

1. Pure EIP          5. 30h after induction

2. Pre-induction      6. 60h after induction

3. 5h after induction  7. Purified EIP

4. 15h after induction