에리스리톨 생산균주인 Moniliella suaveolens

var. nigra의 거품생성원인 분석

이상환, 조성주, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Analysis of foaming in erythritol fermentation

with Moniliella suaveolens var. nigra

Sangwhan Lee, sungju Cho, Hongwoo Park

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

서론

에리스리톨은 4탄당의 당알코올이여, 감미도가 설탕의 80% 정도이며 칼로리량이 설탕의 10% 미만으로 아주 낮고 충치를 유발하지 않으며, 청량감을 주며 가공하기 쉽고 다른 당알코올과 달리 배탈과 같은 부작용이 없기 때문에 아주 우수한 대체 감미료이다.  에리스리톨은 음료, 과자, 쵸코렛, 껌, 사탕, 유제품 등 저칼로리 및 비충치성을 원하는 제품에 다양하게 응용할 수 있다.  또한 고감도 감미료인 아스파탐이나 스테비아와 적당한 비율로 혼합할 경우 설탕의 맛과 유사한 감미도와 함께 저칼로리, 비충치성의 감미료를 만들 수 있다. 에리스리톨은 자이리톨, 솔비톨, 말티톨에 비해 특히 칼로리량이 아주 낮으며 가공성도 우수하기 때문에 상업적으로 충분한 경쟁력을 지니고 있다.

에리스리톨을 생산하는 본 균주의 배양에서 다량의 거품의 발생하였다. 거품의 발생은 발생된 거품층에 세포가 갇혀 있으므로 에리스리톨의 생산수율이 떨어진다. 배양중에 발효기가 넘쳐서 배양 자체를 어렵게 만들 뿐아니라, 배양중에 오염의 원인이 된다.  거품은 교반과 통기에 의하여 기상과 액상의 경계면에 의하여 생성된다. 거품의 크기가 작을수록, 액상내에 불순물이 많을수록 거품의 수명이 길고 거품층의 형성이 잘 된다. 단일한 물질인 경우에는 대부분이 거품이 발생하나 이내 사라진다. 그러나 복합적인 물질인 경우에는 거품이 생성된 후에 이를 지지, 유발하는 물질로 인하여 거품이 지속적으로 생성되어 거품층을 형성한다. 특히 발효공정의 경우 복합적인 배지물질로 인하여 거품이 생성되고 유지되어서 배양에 많은 어려움을 초래한다.(1,3)

발효에서 거품층의 생성은 단백질, 당, 당알코올, 깨진 세포, 지질, 유기산, 배지, 무기물 등이 복합적으로 작용하여 이루어지는 것으로 알려져 있다. 특히 단백질의 경우에 등전점의 범위에서 용해성이 떨어지므로 거품의 생성에 많은 영향을 보이는 것으로 알려져 있다.(2,4,5)

본 실험에서는 거품이 발생하고 유지되는 원인으로 여겨지는 세포농도, 단백질농도, 에리스리톨 및 글리세롤의 농도, 표면장력, pH에 대하여 조사하고 거품생성과의 관계를 분석하였다. 차후에 이 실험에 얻은 자료는 배양중의 거품의 억제방안 연구의 자료로 활용될 것이다.

재료 및 방법

본 실험에서 사용한 시약은 효모 엑기스(yeast extract), 박토 펩톤(bacto peptone), 말트 엑기스(malt extract)는 Difco Co.(U.S.A)로부터 구입하였다. 포도당, 한천, 요소는 Junsei Co.(Japan)에서 구입하였다. 에리스리톨 등의 분석용 시약은 Sigma Co.(U.S.A)에서 구입하였다.

먼저 동결건조된 균주를 평판배지에 도말한 후 30℃, 5일간 항온배양기에서 배양하였다. 이중에서 잘자라는 균주를 사면배지에 접종시켰다. Erythritol 생산을 위한 종배양은 stock slant로부터 균주 1 백금이를 취하여 액체 배지 30 mL가 들어 있는 300 mL 진탕 플라스크에 접종하여 진탕배양기(Vision scientific Co., VS-8480SR)에서 240 rpm에서 3일간 배양하였다. 5L 발효기(한국발효기, KF-5L) 배양은 32℃, 500rpm, air flow rate 0.5vvm (volume/volume/minute)을 기준으로 하여  2L의 액체배지에서 7일 동안 배양하였고, 매일 시료를 채취하였다.

세포농도는 분광광도계(Milton roy, spectronic 20D)로 562nm에서 OD를 측정하였다. 당분석은 유기산칼럼을 사용하여 HPLC(Waters)로 분석하였다. 표면장력은 Kagaku Kyoeisha사의 은고리환 표면장력계를 사용하여 측정하였다. 단백질 농도의 측정은 Lawry 방법을 사용하였다. pH는 Corning사의 ion analyzer 250을 사용하여 측정하였다. 거품층의 높이는 배양기의 1L높이를 기준하여 거품의 높이를 측정하였다.

결과 및 토론

배양액과 거품층에서의 세포농도에 대한 자료는 Figure 1.에 있다. 배양액보다는 거품층에서 더 높은 세포농도를 보이고 있다. 이는 세포가 통기와 교반에 의하여 쉽게 부유한 것으로 판단되며, 이로써 배양액내의 세포농도가 낮아져 포도당의 대사정도가 낮아진다. 또한 배양액의 밀도가 세포에 비해서 차이가 많이나서 더 잘 부유되는 것으로 여겨진다. 그러므로, 초기에 많은 양의 접종이 필요하리라 판단된다.

배양액과 거품층에서의 단백질 농도에 대한 자료는 Figure 2.에 있다. 단백질의 농도는 배양액보다 거품층에서 더 높고, 5일 정도에 고점을 보이고 있다. 이는 배양이 진행되면서 대사가 활발하여 단백질의 양이 증가하고 또한 pH가 낮아져서 분비되는 단백질의 많은 양이 용해도가 낮아지고, 소수성인 단백질들이 공기방울과 결합하여 부상하는 것으로 여겨진다. 5일 이후에는 단백질의 양이 적어지는데 이는 새로운 단백질이 대사과정에서 생성되지는 않으며 생성된 단백질이 분해가 일어나는 것으로 판단된다.

배양액과 거품층에서의 표면장력에 대한 자료는 Figure 3.에 나타냈다. 표면장력은 배양시간이 지날수록 낮아지고, 배양액이 거품층보다도 약간 높은 수치를 보이고 있다. 대체로 물의 표면장력보다는 낮은 수치를 보이고 있다. 이는 단백질과 여타 대사물질이 초기의 배지의 표면장력을 약화시키는 역할을 하는 것으로 여겨진다. 시간이 진행될수록 낮아지는 것은 배지내에 당알코올이나 여러 종류의 단백질, 여타 유기산으로 추측되는 물질이 계속 생성되어서 표면장력을 낮추는 것으로 추축된다.

배양액과 거품층에서의 대사물질에 대한 자료는 Figure 4., 5.에 있다. 대사물질에 대한 결과를 보면 에리스리톨과 글리세롤의 농도가 거품층에서 비슷하거나 약간 높은 수치를 보이고 있다. 이는 대사물질이 세포에서 생성되므로 통기에 의하여 올라가는 많은 세포에서 대사물질이 세포외로 분비되거나, 대사물질이 통기에 의하여 거품층으로 올라가서 단백질이나 세포 및 여타 물질과 엉킴으로서 배양액보다는 거품층에서 대사물질인 에리스리톨과 글리세롤이 많이 존재할 것으로 여겨지나 섞임에 의하여 농도가 비슷하게 유지되는 결과를 보이고 있다.

pH에 대한 자료는 Figure 6.에 나타냈다. pH는 배양액이 거품층보다 낮은 값을 보이고 있다. 전반적으로 3-4사이에 존재하며 배양초기에 산도가 갑자기 떨어지는데 거품층이 증가하는 것과 비슷한 시기에 발생한다. 그러나, 전반적으로 배양중에는 산도의 변화량이 크지 않았다. 원인으로는 산도에 영향을 끼칠만큼 대사산물이 급격하게 분비되지 않은 것으로 판단된다. 배양말기에 산도가 약간 올라가는데 이는 통기로 인하여 산도에 영향을 미치는 물질이 계속적으로 생성되고, 휘발하면서 일정한 수치를 유지하다가 대사활동이 약화되면서 휘발만 있고 생성되지 않았을 가능성과 말기의 자원고갈로 인한 세포분해로 세포내물질이 산도의 상승을 시켰을 가능성도 있다.

거품의 생성에 대하여 살펴보면 2일정도에서 급격하게 발생되는데 이는 세포농도와 단백질의 농도가 거품의 발생 및 거품층의 지지에 큰 변수로 작용하는 것으로 보인다. 또한, 배양액과 거품층의 대사물질의 농도나 산도 및 표면장력등의 값들이 배양액과 거품층의 차이가 유사한데 이는 발생된 거품층의 높이가 낮아서 통기에 의하여 거품층과 배양액과의 섞임이 있는 것으로 판단되며, 위에서 얻은 분석자료들을 종합적으로 검토하면 본 균주의 배양에서 발생되는 거품은 세포와 단백질에 의하여 주로 발생되고, 여러가지 대사물질에 의하여 생성된 거품층이 지지되는 것으로 보인다. 시간이 갈수록 거품이 증가하나 6일 이후에는 거품층은 단백질의 분해로 보이는 원인으로 높이가 감소하는 현상을 보이고 있다.

거품을 줄이고, 에리스리톨의 생성을 늘이기 위한 방안으로는 초기에 접종량을 증가시킴으로서 초기의 세포의 부유로 인한 대사활동의 영향을 최소화하고 온도의 높임이나 생성된 단백질의 분해를 촉진하는 재료의 첨가가 거품을 억제하리라 본다. 물론 적합한 소포제도 배양중의 표면장력을 상당히 낮춤으로써 거품층 자체를 줄일수도 있을 것으로 판단된다.

참고문헌

1. Elmer L. Gaden, Jr., and Victor kevorkian, A Chemical Engineering           Report, Octorber (1956)

2. W. Bumbullis, K.Kalichewski, and K. Sche□gerl, Applied Microbiology and     Biotechnology 7, 147-154, (1979)

3. K.Sche□gerl, Process Biochemistry, August (1985)

4. A. Prins and K. van'tRiet, Tibtech, November (1987)

5. Ian Noble, Mark Collins, Neil Porter, and Julie Varley, Biotechnology and      Bioengineering, 44, 801-807 (1994)

Figure 2. Protein concentration(g/L)          of medium and foam layer

Figure 1. Cell density(OD) of

medium and foam layer

Figure 4. Erythritol concentration

(g/L) of medium and foam layer

Figure 3. Surface tension(dyne/cm)

of medium and foam layer

Figure 5. Glycerol cencentration

(g/L) of medium and foam layer

Figure 6. pH of medium and

foam layer