유기 용매내에서의 효소적 광학분할을 이용한 Captopril 전구체의 생산

이시욱, 정재철, 이선복, 이왕식*, 정구헌*

포항공과대학교 화학공학과, (주)종근당 종합 연구소*

Production of Captopril Intermediate via Enzymatic Resolution

in Organic Solvents

Shi Uk Lee, Jae Chul Jeong, Sun Bok Lee,

Wang Sik Lee*, Koo Hun Chung*

Dept. of Chem. Eng., Pohang University of Science and Technology

Chong Kun Dang, Corp.*

서론

의약품의 경우 크게 천연 생리활성 물질 유래의 의약품과 합성 의약품으로 나눌 수 있다. 천연 물질로부터 얻어진 약품은 거의 대부분이 광학 활성체인 single enantiomer로 시판되고 있으나 합성 의약품의 경우 약 과반수가 racemate 형태로 판매되어 왔다. 그러나 두 가지 enantiomer에 대한 서로 다른 생리 활성의 차이가 인식되면서 single enantiomer 형태의 chiral 약품들이 꾸준히 증가하는 경향을 보였다. 보고에 의하면 미국내에서 가장 많이 소비되는 약품 중에 20%가 single enantiomer인 것으로 알려졌다[1]. Single enantiomer를 얻기 위한 방법에는 사용되는 원료 물질의 형태에 따라 여러 가지가 있으나 racemate와 prochiral 기질을 이용하는 방법이 주류를 이루고 있다. prochiral 기질을 이용하는 비대칭 합성은 생물 촉매[2]나 화학 촉매[3]를 이용하여 광학 활성 물질을 합성하는 방법이다. 그리고 racemate를 이용한 kinetic resolution은 효소 및 화학적 방법을 이용해서 분리하는 것으로 이 중 화학적 방법은 그 과정이 매우 어렵고 여러 단계를 필요로 한다. 그 대안으로 제시된 방법 중 가장 효과적인 방법이 효소를 이용한 방법으로 보다 안정된 조건에서 순수도가 높은 single enantiomer를 얻을 수 있다. 특히 유기 용매 내에서의 효소 반응은 수용액 상의 반응과 달리 소수성의 반응 기질을 사용할 수 있고 화학 평형을 합성 쪽으로 유도할 수 있는 점 등으로 인해 최근 폭 넓게 연구되어 왔다.

현재 고혈압 치료제로 사용되어지는 Captopril, Enalapril, Lisinopril등은 여러 가지 종류의 Angiotension Converting Enzyme (ACE) Inhibitor들이다. 이 치료제들은 모두 single enantiomer형태로 판매되고 있는 광학이성질체로서, 특히 Captopril의 경우에는 1990년 기준 연간 15억 달러의 매우 큰 규모를 갖는 의약품이다[4].

Captopril 제조 방법은 크게 화학적인 방법과 미생물을 이용한 발효법을 포함한 생물학적 방법으로 나뉜다. 화학적 합성법의 경우에는 1977년 Ondetti에 의해 제시된 초기 방법[5]과 1980년 Oce Andeno[6]에 의해 제시된 방법이 있다. 전자의 경우 resolution 단계의 낮은 효율성 때문에 비싼 원료의 회수 단계가 필요하지만 후자의 경우는 resolution 단계를 미리 시행하여 그러한 회수 단계가 불필요하였다. 그러나 역시 resolution에 대한 낮은 효율성이 문제시 되었다. 생물학적 합성법에 대해서는 미생물을 이용한 발효법의 경우 Ohta, Seebach, Hasegawa 그룹[7] 등이 연구하여 보고 하였다.

한편 화학적 합성 단계에서의 초기 물질인 methacrylic acid를 이용한 유기 합성 방법에 있어서 가장 문제가 되는 공정이었던  racemate로부터 chiral compound를 분리해내는 일은 최근 들어 다양한 종류의 범용 lipase를 이용한 유기 용매 상에서의 효소 반응으로 보안된 보고가 있다[8]. 이러한 효소 반응은 기존의Captopril 생산 방법들의 단점을 보완할 수 있어 의약품 생산 공정에 관련하여 반드시 연구, 개발되어져야 하는 부분으로 평가되고 있다.

본 연구에서는 정밀화학 분야에서 의약품들 중 거대한 시장을 형성하고 있는 광학 활성 합성 의약품의 개발에 있어서 필수적인 광학 활성의 중간 물질을 화학적인 방법과 생물학적 방법을 혼용하여 생산하였다. 즉, 화학 합성법에 의해 특이한 기질을 제조하여 여기에 입체선택성 (stereoselectivity)과 입체특이성 (stereospecificity)이 우수한 lipase를 이용하여 유기 용매 상에서의 esterification 반응을 수행하였다. 그리하여 Captopril의 중간 원료인 (R/S)-3-benzoylthio-2-methylp- ropanoic acid로 부터 목적으로 하는 (S)-3-benzoylthio -2-methylpropanoic acid를 얻는 실험을 실시하였다(Fig. 1).

Fig. 1 Stereoselective esterification by lipase

실험 방법

효소 반응에 사용한 기질인 (R/S)-3-benzoylthio-2-methylpropanoic acid는 현재 제품화 되지 않은 것으로 직접 제조[9]하여 NMR 분석 후 사용하였고 alcohol은 methanol을 사용하였다. 또한 screening에 이용된 효소는 Amano (Lipase A,AK,AY, D,F,G,L,M,PS,R), Sigma (Lipase Type II,VII), Meito Sangyo (Lipase AL,OF,PL,QL), Novo (Novozym 667BG)사의 제품들로 더 이상의 분리, 정제는 하지 않았다. 계속된 실험에서 사용한 alcohol류는 Aldrich Chemical Co.제품을, 유기 용매류는 Mallinckrodt, Aldrich Chemical Co., Junsei Chemical Co. 제품을 사용하였다.

유기 용매 내에서의 esterification 반응은 기질을 유기 용매에 녹인 후 일정한 수분을 첨가하여 sonication한 후 이 용액을 효소가 담지된 10ml vial에 첨가한 후 10분 동안 shaking incubator 내에서 교반한 후 alcohol을 첨가하면서 반응을 진행시켰다.

반응 후의 기질(acid)과 생성물(ester)의 분석은 HP Capillary column (HP-1)을 이용한 gas chromatography (GC)방법을 사용하여 FID (Flame Ionization Detector)로 온도를 210oC oven, 250oC injector,detector로 하여 사용하였다.

한편, 목표로 하는 미반응 (S)-3-benzoylthio-2-methylpropanoic acid의 광학 순수도 측정은 대부분의 경우에 사용되는 chiral column 방법을 시도하였으나 분리되지 않아 다른 방법으로 chiral reagent를 이용한 diastereomer 합성법[10]으로 측정하였다. 분석은 gas chromatography (GC)를 이용하여 위와 같은 조건에서 실시하였다.

결과 및 토론

본 연구에서는 생물학적인 방법과 화학적인 방법을 혼용한 방법, 즉 기질인 racemic acid를 합성하여 여기에 입체선택성 (stereoselectivity)과 입체특이성(stereospecificity)이 높은 lipase를 선별하여 유기 용매 상에서의 esterification 반응을 이용하여 (S)-form의 chiral compound를 생산해내는 실험을 수행하였다. 사용된 기질은 직접 제조하여 사용하였으며 lipase는 현재 시판 중인 제품을 사용하여 screening 하였다.

그 결과 대부분의 lipase들 (Candida rugosa, Rhizopus sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. 등)은 기질에 대해서 매우 낮은 기질 특이성을 나타내었으나 , 그 중에서 Lipase AK (Pseudomonas  Fluorescens)와 Lipase PS (Pseudomonas cepacia)만이 비교적 높은 광학 순수도를 나타내었다 (ees 90% 이상).

반응에 기질로 사용되는 alcohol은 methanol이외에 propanol, pentanol, heptanol, decanol등을 사용하여 실험하였으나 모두 초기 반응 속도 (mM/hr)와 광학 순수도가 methanol보다 낮게 나타났다. 따라서 두 가지 측면에서  목적물 분리 시 조업이 간단한 이점을 지니고 있는 methanol을 반응 기질로 사용하였다.

일반적으로 유기 용매내에서도 효소는 입체 선택성을 유지한다. 그러나 반응 기질을 유기 용매로 바꾸면 어떤 효소는 enantioselectivity가 변한다[11,12]. 예를 들면 lipase의 경우 물에서의 가수 분해에 비해 유기 용매내의 esterification 반응이 더 enantioselective하다. 여기서 유기 용매의 효소에 대한 영향으로 기준으로 사용될 수 있는 것이 유기 용매의 hydrophobicity를 나타내는 log P 값이다. 각기 서로 다른 log P 값을 갖는 유기 용매들 중에서 기질에 대한 용해도가 비교적 높은 aromatics 중에서 pyridine (log P=0.7), benzene (log P=2.0),  toluene (log P=2.54), xylene (log P=3.1)을 사용하였다. 여기서 log P 값이 2 미만인 용매의 경우 효소의 단백질 구조에 큰 영향을 미쳐서 활성을 감소시키는 현상이 발생하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실은 pyridine을 사용한 경우 효소 자체의 활성이 감소되어 반응이 거의 진행되지 않는 것으로 확인하였다. 나머지 3가지 경우 유기 용매의 hydrophobicity가 감소함에 따라  초기 반응 속도는 감소하였고, 광학 순수도는 증가하다가 log P값이 2인 benzene의 경우 다시 감소하여 결국, toluene이 가장 적당한 유기 용매로 판명되었다.

유기 용매 내에서의 효소 작용은 유기 용매의 특성 뿐 아니라 함유된 물의 양에 의해 크게 좌우된다[13,14]. 시스템에 따라 물의 양이 증가할수록 효소의 enantioselectivity는 증가하거나 감소한다. 그러나 효소마다 필요한 최소한의 물의 양은 각기 다르므로 그에 대한 실험을 실시하였다. Fig.2는 물의 양에 따른 전환

- Enantiomeric excess, [eqn: ee~(%)~=~ {[S]-[R]} over {[S]+[R]}~X~100]

- E-value, [eqn: E~=~ {ln(1-C)(1- {ee}_{S})} over {ln(1-C)(1+{ee}_{S})}~=~{ln(1-C(1+{ee}_{P}))} over {ln(1-C(1-{ee}_{P}))}]

where C : conversion (%).

ees : enantiomeric excess of substrate.

eep : enantiomeric excess of product.

[S] : fraction of S-form substrate remaing.

[R] : fraction of R-form substrate remaing.

Fig. 2 The effect of water content on reaction rate and E-value. Reaction conditions: 0.5g of Lipase PS, 0.025M (R/S)-3-benzoylthio-2-methylpropanoic acid, 0.1M methanol, 40oC, 200rpm, 10ml of toluene.

률 (conversion)과 최종 시간에서의 효소의 E-value (식 참조)를 나타내었다. 실험한 조건에서는 물의 양이 증가함에 따라 반응 속도도 증가하여 0.4%(v/v)의 경우 0.1%(v/v) 보다 약 3배의 초기 반응 속도를 나타내었다. 또한 효소의 enantioselectivity는 물의 양에 따라 크게 변하여 0.2%(v/v) 경우 0.1%보다 4배 정도로 높게 나타났다. 그러나 0.3% 이상 물이 존재할 경우 다시 감소하게 되어 결국 반응 속도와 광학 순수도 측면에서는 물 함량이 0.2%, 0.3%(v/v)인 경우가 반응에 적당한 조건임을 알 수 있었다.

참고 문헌

1. Stinson, S. C., Chem. Eng. News, September 19, 38(1994).

2. Hamilton, B. K. et al., Trends Biotechnol. 3, 64(1985).

3. Knowles, W. S., et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 2567(1975).

4. Sheldon, R. A., 'Chirotechnology', pp 49, 58, 128-134, 159, 362-367(1993).

5. Cushman, D. W. et al., Biochemistry, 16, 5484(1977).

6. Sheldon, R.A. et al, Biocatalysts in Organic Synthesis, Tramper, J., Vander

Plas, H. C., and Linko, P.(Eds.), Elsevier, Amsterdam, pp 59-80(1985).

7. Hasegawa, J. et al., J. Ferment. Technol., 60, 501(1982).

8. Patel, R. N. et al., JACOS, 73, 1363(1996).

9. Howell et al., US patent no. 5420037(1995).

10. Jemal, M. et al., J. Chromatogr., 394, 388-394(1987).

11. Lee, S. B., J. Ferment. Bioeng., 80, 141-147(1995).

12. Lee, W. H. et al, J. Ferment. Bioeng., 80, 613-615(1995).

13. Lee, S. B. et al, J. Ferment. Bioeng , 79, 473-478(1995).

14. Kim, M. G. et al, J. Ferment. Bioeng, 81, 269-271(1996).