Steinernema glaseri로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus의 상변화

유연수, 박선호

계명대학교 화학·재료공학부

Phase Variation of Xenorhabdus nematophilus Isolated

from Steinernema glaseri

Yeon Su Yu, Sun Ho Park

School of Chemical Engineering and Materials Engineering,

Keimyung University, Taegu 704-701

서 론

곤충병원성선충(entomopathogenic nematodes)은 뛰어난 기주탐색능력과 높은 치사율, 기타 포유류 및 식물에 대한 안정성 때문에 생태친화적인 차세대 무공해 생물살충제로 크게 기대되고 있다(1-2). 곤충병원성 선충은 공생세균을 분비하여 해충을 24-48시간 내에 사멸시키는데 그 효과가 매우 뛰어나고 활용범위가 넓을뿐만 아니라 기타 천적류에 비하여 생태계적인 부작용을 줄일수 있다는 측면에서도 장점이 있다. 그러나 선충의 공생박테리아는 성장조건에 따라 phase 1 또는 phase 2의 상태로 변화될수 있는데 이를 동질이형화(dimorphism)현상이라 부른다. phase 1은 동질이형인 phase 2에 비해서 대사가 더 활발하며, in vitro 배지에서  phase 2의 출현은 일반적으로 감염단계선충(infective juvenile nematodes)의 수율을 낮게하는 것으로 알려져 있다(3).

최근 이와 관련하여 국내에서 채집된 곤충병원성선충인 Steinernema glaseri로부터 공생박테리아인 Xenorhabdus nematophilus를 분리·동정하였는데(4), 본 연구에서는 이 균주의 상변화특성 및 배양조건을 조사하였다.

실험재료 및 방법

Xenorhabdus nematophilus를 NBTA 배지에서 3-5일간 성장한 colony를 250mL flask에서 working volume 100mL의 성장배지에 접종하여 shaking incubator에서 28℃, 200RPM으로 배양하였으며 균체농도는 UV-VIS spectrophotometer(Smart 190DUV)를 사용하여 560nm에서 증류수를 이용하여 50배 희석하여 O.D.(optical density)를 측정하였다.

Xenorhabdus nematophilus의 성장배지중 yeast extract의 영향을 조사하기 위해서 0.5% NaCl, 0.05% KH2PO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O를 기본배지로 yeast extract의 농도를 0, 0.5, 1, 3, 5, 7%로 증가시켜 배지를 조제하였다. 그런다음 Xenorhabdus nematophilus를 접종하여 시간에 따른 O.D.와 pH의 변화를 조사하였다.

또한 Xenorhabdus nematophilus를 5% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.05% KH2PO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O 배지조성 하에서 flask와 fermentor에서 각각 배양하여 비교하였다. Flask배양에서는 250mL flask에서 working volume 100mL로 28℃, 250rpm 하에서 약 150시간동안 진탕배양하였으며 fermentor배양에서는 7L fermentor(KFC, Korea) 시스템에서 working volume을 5L로하여 온도 28±0.5℃, 1L/min air flow rate, 600 RPM 하에서 약 60시간 동안 배양하였다. 이때, pH는 조절하지 않고 배양을 실시하였다. 또한 균주가 flask와 fermentor에서 각각 배양할 경우 발생하는 상변화의 정도를 조사하기 위해서 배양액을 NBTA에 plate out하여 28℃에서 3-5일 배양한 후 colony의 색을 확인하였다. 이때 phae 1은 BTB(bromothymol blue)를 흡수하여 blue 혹은 green인 반면, phase 2는 red를 보였다.

결과 및 토의

Fig. 1은 Xenorhabdus nematophilus를 0.5% NaCl, 0.05% KH2PO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O를 기본배지로 yeast extract의 농도를 0, 0.5, 1, 3, 5, 7%로 증가하였을 때의 성장곡선과 pH 변화를 나타낸 것이다. Yeast extract의 농도는 5%까지 증가할 때 최대세포농도가 증가하였지만 5%보다 높은 7% yeast extract농도에서는 거의 비슷한 최대세포농도를 보였다. 또한 pH는 초기 6.8-7.0 정도에서 균주가 성장함에 따라 pH 9.0까지 증가하였다.

Fig. 2는 yeast extract 농도에 대한 Xenorhabdus nematophilus의 최대세포농도와 비성장속도를 나타낸 것이다. Yeast extract의 농도가 증가함에 따라 최대세포농도가 증가하는 경향을 보이는데 이는  yeast extract의 농도가 균주성장에 limiting factor로 작용함을 보여준다.  Yeast extract 농도에 대한 비성장속도의 의존도를 Monod equation을 가정하여 비교해 본 결과, 최대 비성장속도는 0.13hr-1이고 Monod 상수값은 2.5%였다.

Fig. 3은 5% yeast extract, 0.5% NaCl, 0.05% KH2PO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O를 기본배지로 하여 균주를 250mL flask에서 working volume 100mL로 28℃, 200rpm에서 진탕 배양했을때와 7L fermentor에서 working volume 5L로 배양했을때의 성장곡선을 비교한 것이다. Fermentor배양은 28℃, 600rpm, 1L/min air flow rate  조건 하에서 실행되었으며, 균주가 성장함에 따라 pH가 초기 6.8에서 9.2까지 증가하였다(data not shown). 한편 균주의 최대세포농도는 fermentor(0.62)에서 배양한 경우와 flask(0.58)에서 배양한 경우가 비슷한 값을 보였으나 비성장속도에 있어서는 fermentor배양에서는 약 0.17 hr-1로 flask배양의 약 0.12 hr-1보다 약 1.4배 더 큰값을 보였다. 이것은 fermentor배양에서의 aeration과 mixing 조건이 더 좋은 것 때문으로 생각되며, Xenorhabdus nematophilus가 조건적 혐기성(facultatively anaerobic)균주이지만 호기성조건에서도 잘 성장하는 것으로 생각된다. 그러나 상변화에 있어서는 fermentor에서 배양한 경우가 flask에서 배양한 경우보다 빠르게 phase 1에서 2로 진행되는데 이것은 균주의 성장속도가 증가함에 따른 것으로 생각된다. 또한 두 배양조건에서 모두 배양초기에는 phase 1이 80%이상 유지되지만 정지상(stationary phase)에서는 빠른 속도로 phase 1이 감소하였다.

감사

본 연구는 1997년도 한국과학재단  연구비(970-4020-201-3)지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Park, S. H. and Kim, D. W.: Korean J. Biotechnol. Bioeng. 12(3),

261-268(1997)

2. Park, S. H. and Kim, D. W.: Current Biochemical Engineering 2(2),

29-34(1997)

3. Boemare, N. and Akhurst, R. J.: J. Gen. Microbiol. 134, 751-761(1988).

4. Park, S. H. and Yu, Y. S.: Biotechnol. Bioprocess Eng., submitted(1998).

Fig. 1. Profiles of pH and cell concentration of Xenorhabdus nematophilus             varying yeast extract concentration : (□) 0.5%, (□) 1.0%, (□) 3.0%,

(□) 5.0%, (□) 7.0%. Fermentations were carried out at 28℃ for 150

hrs in 250mL flask.

Fig. 2. Effect of yeast extract concentration on maximum cell density(-●-)

and specific growth rate(-□-) of Xenorhabdus nematophilus.

Fig. 3. Comparison of cell growth and phase variation between 7L

fermentor(-□-) and 250mL flask(-●-) cultures.