배양조건에 따른 곤충병원성 선충의 공생 박테리아의 상변화

배준상, 최은석, 류근갑

울산대학교 화학공학부

Phase Variation of a Symbiotic Bacterium of an Entomopathogenic Nematode

in Various in Vitro Growth Media

Jun-Sang Bae, Eun-Suk Choi, Keun-Garp Ryu

School of Chemical Engineering, University of Ulsan

서론

환경오염 문제를 일으키는 화학적 살충제를 대체하기 위한 무공해 생물학적 살충제의 개발이 활발히 연구되고 있다. 해충에 대해 선택적인 병원성을 가지고 있는 여러 종류의 곤충병원성 선충은 자연 생태계에 존재하는 유용인자로 사람이나 가축 등에 부작용이 없고, 대상 해충의 범위가 넓으며, 해충에 내성을 일으키지 않고, 또한 해충 탐색 능력이 뛰어난 장점이 있다.

선충에 의한 해충의 파괴는 선충 내에 공생하는 박테리아에 의한 것임이 밝혀지고 있다. 즉 공생 박테리아를 가지고 있는 선충은 해충의 입, 기문 등을 통해 해충의 혈장에 침투하여 공생 박테리아를 해충 내에 유출시킨다. 이 공생 박테리아는 해충 내에서 toxin을 생성하여 24∼48시간 안에 해충을 사멸시키는 동시에 사멸된 해충의 부패를 방지하여 선충의 증식에 필요한 영양소를 제공한다(1). 해충을 사멸시키는 직접적인 원인인 공생 박테리아가 생산하는 toxin의 종류로는 단백질 분해 효소(2) 혹은 효소가 아닌 단백질인 것으로 밝혀지고 있다.

이 공생 박테리아의 중요한 특징 중의 하나는 토양이나 수중에서 잘 증식하지 못하고(3) 선충에 의해 해충내부에 침입하지 못하면 병원성을 발휘하지 못하는 것이다. 이는 공생 박테리아가 Phase Ⅰ과 Phase Ⅱ의 두 가지 상태로 존재하기 때문이다. 이러한 상변화에 대한 유전적 원인은 아직 잘 알려져 있지 않지만 선충의 곤충병원성에 매우 큰 영향을 미치는 중요한 요인의 하나로 생각되고 있다. 특히 Phase Ⅰ의 공생 박테리아는 해충 사체 내에서 선충과 함께 증식할 때 다른 미생물의 성장을 방해하는 항생물질이나 기타 영양성분을 만들어(4) 선충의 증식과 배양에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 반면, Phase Ⅱ의 공생 박테리아는 이러한 항생물질이나 영양성분을 충분히 만들어 내지 못하기 때문에 선충 증식이나 곤충병원성도 크게 떨어지는 것으로 알려져 있다.

곤충병원성 선충의 살충 mechanism 연구 및 상업화를 위해서는 공생 박테리아의 대량 배양 및 살충 물질의 규명 등이 필요하다. 이를 위해서는 in vitro 배양조건에 따라 공생 박테리아의 Phase 변화를 규명하는 것이 필요하다.

본 연구에서는 우리 나라 토양에서 채집한 병원성이 강한 선충인 Steinernema carpocapsae Weiser에 공생하는 박테리아인 Xenorhabdus nematophilus를 이용하여  여러 가지 in vitro 배양조건에서 공생 박테리아를 배양하여 Plate 배양(고체배양) 및 액체 배양시 배양 단계에 따른 Phase 변화를 관찰하였다.

실험

Plate 배양

Plate 배양 배지는 NBTA 배지를 사용하였다. NBTA 배지는 Nutrient Agar(NA) (20g/□) 와 Bromothymol Blue(BTB)(25□/□), Triphenyltetrazolium Chloride(TTC) (40□/□)등이 포함된 것으로 제조하였으며 공생 박테리아를 배양하여 Phase를 확인할 수 있는 배지이다. Phase Ⅰ 공생 박테리아인 경우는 Individual Colony Color가 Green이 되고 Phase Ⅱ일 때는 Red가 나타난다.

배양은 Source Plate에서 Colony(Green + Red)가 나타나면 transfer를 시작해 연속적으로 Plate에 도말하는 방법으로 하는데 Phase Ⅰ 과 Ⅱ를 구분해서 배양했다.   Plate는 25℃ incubator에서 배양시키고 4∼7일 후 Cell 성장 상태와 Phase를 관찰한다.

액체 배양

①냉동 보관용 40% Glycerol Seed 준비

먼저 Glycerol과 배지 조성이 Yeast extract(5%), NaCl(0.5%), KH2PO4(0.5%) 인    액체 배지를 혼합(80/20, v/v)하여 80% Glycerol 용액을 준비한다. 배지 조성이    Yeast extract(5%), NaCl(0.5%), KH2PO4(0.5%)인 액체 배지(working vol. 50mL,      flask vol. 250mL)에 Plate 배지에서 성장중인 공생 박테리아(Phase Ⅰ- Green      Colony)를 접종시켜 25℃, 100rpm incubator에서 약 3일간 배양한 배양액을 80%   Glycerol 용액과 혼합(50/50, v/v)하여 냉동보관용 40% Glycerol Seed를 준비한다.

②Seed 배양

냉동보관 된 40% Glycerol Seed 1mL을 Yeast extract(5%), NaCl(0.5%), KH2PO4    (0.5%)의 액체 배지(working vol. 50mL, flask vol. 250mL)에 접종하여 약 3일간    25℃, 100rpm incubator에서 배양한다.

③본배양

Seed를 Exponential Growth 상태가 될 때까지 배양(3日)한 후 그 배양액 2mL를   본배양 배지(working vol. 50mL, flask vol. 250mL)에 접종한다. 배지는 Nitrogen    Source로 Peptone(1.5%)을 사용했고 Carbon Source로 단당류인 Fructose(3%)를 사   용했다. 그 외 NaCl(0.5%), KH2PO4(0.25%)를 함께 넣었다. 배양은 25℃, 100rpm   incubator에서 한다.

액체 배양은 위의 순서를 따라서 실험하고 냉동보관용 40% Glycerol Seed,   Seed 배양액, 그리고 본배양 각각 배양 단계마다 sampling을 해서 NBTA 배지에  서 Plate 배양해 Phase를 관찰하였다. 본배양에서는 일정한 시간마다 sample을 취  해 Phase, Cell 성장 상태, 배양액 pH등을 알아보았고 현미경 관찰을 통해 Cell을  관찰하였다.

결과 및 토론

Plate 배양시 기간에 따른 공생 박테리아의  Phase 변화

공생 박테리아의 종균은 고체배양(Plate 배양)에 의해서 유지되었으며, 이때 계대배양 주기를 결정하기 위해서 Source Plate에서 Colony가 관찰되기 시작한 후(0日) 매일 Phase Ⅰ(Green)과 Phase Ⅱ(Red) Colony를 각각 새로운 NBTA Plate 배지에 transfer 해서 Phase 변화와 Cell 성장 상태를 관찰하였다.

Source Plate의 Phase Ⅰ(Green color colony)를 transfer했을 경우 대체로 성장 상태가 좋지 않았다. 그 반면 Phase Ⅱ(Red color colony)는 비교적 성장 상태가 좋은 것으로 관찰되었다. <Table 1.>

도말 상태가 좋으면 그 Cell은 적어도  8일 이상 transfer해도 문제가 없다. 하지만 장시간 관찰 결과 Red Colonies가 Green Colonies로 변이 되는 것을 알 수 있었다.

Green 과 Red Colony를 현미경으로 관찰한 결과 Phase Ⅰ 박테리아의 크기는 1∼2□, Phase Ⅱ 박테리아는 이보다 더 큰 4∼6□로 관찰되었다.

결론적으로 Phase Ⅰ 공생 박테리아의 종균을 유지하기 위해서는 Colony 발생 후 3일 이내에 새로운 Plate에 transfer 하는 것이 필요하다.

액체 배양시 기간에 따른 공생 박테리아의 Phase 변화

냉동보관용 40% Glycerol Seed를 Plate에 도말한 결과 Red Colonies가 나타났다. 그리고 40% Glycerol Seed를 약 3일간 액체 배양한 배양액을 Plate에 도말한 결과 Green Colonies가 나타났다.

본배양에 들어가 3일이 될 때까지의 배양액을 Plate에 도말 했을 때 Green Colonies가 관찰되었고 5일부터 조금씩 Red Colony가 나타나기 시작했으며 19일의 배양액을 Plate 배양 했을 때는 완전히 Red Colonies만 나타나게 되었다.

배양 전체로 보았을 때 공생 박테리아의 Phase는 Ⅱ에서 Ⅰ으로 다시 Ⅰ에서 Ⅱ로 변화되었다. <Table 2.>

현미경 관찰에서도 Plate 배양에서와 같이 본배양 초기에는 일정한 크기의 박테리아가 관찰되었으나 시간이 지날수록 크기의 차이를 볼 수 있었다.

Optical Density를 이용해 Cell Growth를 측정한 결과 48hrs 정도 지나면 Stationary 상태에 도달하게 되고 그 이후 계속 그 상태를 유지한다. 전형적으로 나타나는 Lag 와 Death 상태는 나타나지 않았다. <Figure 1.>

배양액의 pH는 초기 pH 6 정도 였는데 48∼240hrs동안에는 pH 8을 유지했고 그후 초기 pH를 회복했다. 최고 pH는 8.28로 측정되었다. <Figure 2.>

<Table 1.> Plate(NBTA 배지) 배양의 Phase 변화

day	Source Colony Color	Colony Growth State	Growth Colony Color
0 day	G	△	G
	R	○	G+R
1st day	G	△	G
	R	○	G+R
2nd day	G	△	G+R
	R	○	G+R
3rd day	G	○	G+R
	R	○	G+R
4th day	G	△	R
	R	○	G+R
5th day	G	△	G+R
	R	○	R
6th day	G	×	-
	R	○	G+R
7th day	G	×	-
	R	△	G+R
8th day	G	△	R
	R	△	G+R

Colony Growth State - 〔 ○: good, △: middle, ×: bad 〕

Colony Color - 〔 G : green, R : red, G+R : green and red mix 〕

배 양 단 계	Colony Growth State	Growth Colony Color
냉동보관용 40% Glycerol Seed	○	R
Seed 배양	○	G
본배양 1st day	○	G
본배양 3rd day	○	G
본배양 5th day	○	G+R
본배야 10th day	○	G+R
본배양 14th day	○	G+R
본배양 19th day	○	R

<Table 2.> 액체 배양의 배양 단계별 Phase 변화.

Colony Growth State - 〔 ○: good, △: middle, ×: bad 〕

Colony Color - 〔 G : green, R : red, G+R : green and red mix 〕

참고문헌

1. Khan, A., W. M. Brooks, and H. Hirschmann (1976), Chromonema hellothidis n.g., n. sp. (Steinernematidae:Nematoda), A Parasite of Hellothis zea (Noctuide: Lepidoptera) and Other Insects. J. Nematol., 8, 159.

2. Kaya, H. K., R. A. Bedding, and R. J. Akhurst (1993), An Overview of Insect- parasitic and Entomopathogenic Nematodes, In; Nematodes and Biological Control of Insect Pests, (R. A. Bedding, R. J. Akhurst, and H. K. Kaya, eds.)., CSIRO, Australia

3. Poinar, G. O. Jr. (1979), Nematodes for Biological Control of Insects, p. 277, CRC Press, New York.

4. R. J. Akhurst (1980), Morphological and Functional Dimorphism in Xenorhabdus spp., Bacteria Symbiotically Associated with the Insect Pathogenic Nematodes, Neoap-

lectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol., 121, 303.