무단백 배지를 이용한 CHO 세포의 부유식 배양

최용운, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Suspension Culture of CHO Cells Using a Protein-free Medium

Yong-Woon Choi, Hong-Woo Park

Department of Chenmical Engineering, Hanyang University

서론

진단제와 치료제 등의 유용한 재조합 단백질을 생산하는 데에 있어서, 미생물을 숙주로 이용하면 번역 후 수정(post-translational modification)이 정확히 일어나지 않아 문제점을 일으키게 되었다.  따라서 고등한 동물세포배양의 필요성이 대두되었다.  동물세포 중 산업에서 많이 이용되는 CHO 세포는 바닥에 붙어 자라는 성질을 가지고 있고 대량배양을 목적으로 Cell Factory를 사용하거나 roller bottle과 microcarrier 등을 사용하고 있다.(1,2,3)  보다 용이한 scale-up을 위하여는 고착식 CHO 세포를 부유식 배양으로의 적응연구가 필요하다.  본 연구는 무단백 (protein-free) 배지를 이용하여 적응과정없이 고착식 CHO 세포의 부유식 배양여부를 연구하며 혈청 농도가 세포성장에 미치는 영향을 살펴보고 무단백 배지를 이용하여 CHO 세포의 부유식 배양으로의 세포적응을 살펴보고자 하였다.

실험

1. CHO세포배양

세포주는 간염 B 바이러스의 surface antigen에 결합하는 항체를 생산하는 Chinese Hamster Ovary(CHO) 세포(DG44)를 사용하였다.

T-flask 배양의 경우, 배지로는 2.2g/L NaHCO3(Sigma), 320nM MTX가 첨가된 MEM□(Gibco) 배지를 사용하였으며 FBS(Moregate)는 농도별로 첨가하였다. 배양은 37℃, 5% CO2 incubator에서 수행되었다.  계대배양은 confluency가 80-90% 정도되면 실시하였으며 0.2% trypsin(Gibco)를 처리하는 trypsinization을 통해 고착된 세포를 떼어내었다.

Spinner flask 배양의 경우, 일정 세포수가 T-flask에서 확보되면 trypsinization을통해 250mL spinner flask(Bellco)로 세포를 옮겨주어 배양을 하였다.  배지로는 320nM MTX가 첨가된 MEM□ 배지와 protein-free 배지인 GC-CHO-P1(녹십자) 배지를 사용하였으며 필요시 혈청은 농도별로 첨가하였다.  배양부피는 50-100mL이고, 초기세포농도는 4-5×105 cells/mL로 하였다.  배양은 37℃, 5% CO2 incubator 또는 일반 incubator에서 실시하였으며 교반속도는 50rpm으로 하였다.

세포수는 역위 현미경을 가지고 결정하였으며 생존율은 Trypan blue(Gibco) 염색을 통해 haemocytometer를 가지고 결정하였다.

2. 부유식 배양으로의 세포적응 실험

GC-CHO-P1 (w/ 2.5% FBS) 배지로 부유식 배양에 적응시키려는 실험은 Table I에 나타내었다.

Table I. Adaptation experiments for CHO cell to GC-CHO-P1(w/ 2.5% FBS) medium

Culture	Exp. I	Exp. II	Exp. III
T-flask	MEM□(w/ 5% FBS)	MEM□(w/ 5% FBS)	MEM□(w/ 5% FBS)
	□	□	□
	□	□	MEM□(w/ 2.5% FBS)
	□	□	□
Spinner flask	□	GC-CHO-P1 (w/ 5% FBS)	□
	□	□	□
	GC-CHO-P1 (w/ 2.5% FBS)	GC-CHO-P1 (w/ 2.5% FBS)	GC-CHO-P1 (w/ 2.5% FBS)

결과 및 토의

먼저 혈청이 세포성장에 얼마나 영향을 미치는지 살펴보기 위해 T-flask에서 여러 혈청농도에 따른 세포성장을 살펴보았다.  Fig. 1에 나타난 것과 같이 혈청의 농도가 낮은 경우 성장이 둔함을 볼 수 있었다.  이밖에 혈청을 포함하지 않은 MEM□ 배지에서는 세포들이 둥근 모양으로 불완전하게 붙어 있다가 시간이 지나면서 부유하게 되었으며 모두 죽은 세포들이었다(자료는 제시되지 않았음).  한편, 혈청을 첨가하지 않은 GC-CHO-P1 배지에서는 세포가 붙어 존재하기는 했지만 별다른 성장은 보이지 않았다(자료는 제시되지 않았음).  즉 본 세포주는 성장하는데 혈청농도에 민감함을 알 수 있었다.

부유식 배양의 경우, 먼저 기본배지로 MEM□와 GC-CHO-P1 배지를 사용하고 혈청 5%를 첨가한 배지를 사용하여 spinner flask 배양에서 세포성장을 살펴보았다.  Fig. 2에서 보듯이 5% 혈청을 포함한 MEM□ 배지에서는 세포의 생존률은 90% 가량으로 유지는 잘 되었으나 세포의 성장은 거의 없었다.  시간에 따라 세포의 수가 계속 줄어드는 것은 세포들이 응집현상을 일으켰기 때문이다.  반면 5% 혈청을 포함한 GC-CHO-P1 배지에서 세포는 doubling time이 24시간 정도로 lag없이 부유식 배양으로 잘 성장하였다.  즉 이 CHO 세포는 GC-CHO-P1 배지를 이용한 부유식 배양에서 혈청을 첨가하여 적응기간없이 잘 성장하였다.  하지만 GC-CHO-P1 배지만을 이용한 부유식 배양의 경우는 세포들이 성장하지 않았다(자료는 제시되지 않았음).  따라서 혈청의 양을 점차적으로 낮추는 방법을 통해 세포들을 적응시키면서 혈청을 완전히 제거하려는 방안을 모색하였다.

직접 GC-CHO-P1 배지만을 사용한 부유식 배양공정을 수립하기 위하여 먼저 혈청이 2.5% 포함된 GC-CHO-P1 배지로 부유식 배양에 적응시키려는 실험을 Table 1에 나타난 대로 수행하였다.  배양결과는 Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5에 각각 나타냈었다.  T-flask에서  자라난 세포들을 trypsinization 시켜 직접 2.5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1 배지로 옮겨 spinner flask 배양을 한 결과, 세포의 성장은 doubling time이 48시간 가량으로 약간 더디면서 점차적으로 활성도가 낮아졌다.  3계대 후, 혈청이 포함되지 않은 GC-CHO-P1 배지로 옮겼으나 세포의 생존율은 급속히 떨어지면서 결국 거의 다 죽어갔다.  T-flask에서 모은 세포를 먼저 5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1 배지로 옮긴 후 spinner flask 배양을 3계대배양한 뒤에 2.5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1 배지로 옮겨 배양한 결과,  5% 혈청이 포함된 배지에서는 Fig. 2와 마찬가지로 부유식 배양이 잘 되었으나 2.5% 혈청이 포함된 배지로 옮긴 후에서는 세포성장이 다시 더디게 되었다. 그러나 직접 2.5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1에 옮긴 것보다는 약간 성장이 좋았다.  마지막으로 T-flask에서 먼저 2.5% 혈청이 포함된 MEM□ 배지에서 세포배양 후, 자라난 세포들을 trypsinization 시켜 직접 2.5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1 배지로 옮긴 것이다.  세포성장은 처음에 lag가 있다가 급속히 성장하였으나, 계대 후에 성장은 약간 둔화되었다.  위의 세가지 실험을 통해 무단백 배지로 부유식 배양에 적응시키는 방안으로 Exp. III처럼 미리 T-flask에서 혈청농도를 낮추어 적응시키고 난 후, spinner flask 배양을 수행하는 것이 보다 좋은 것으로 밝혀졌다.

다른 방법으로 먼저 T-flask 배양에서 GC-CHO-P1 배지로 적응시킨 후, 부유식 배양으로의 적응여부를 관찰하기 위하여 Fig. 1의 실험에 이어서 PBS로 두번 washing 후, GC-CHO-P1 배지를 넣고 3일간 배양하였다.  여기서는 세포들이 보다 조밀하게 붙어 자랐으며 세포들 사이에 공간이 듬성듬성 나타나고 있었다.  보통 T-flask에 처음부터 무혈청 배지를 첨가하면 세포들은 막대형이나 성상형을 나타내지 않고 둥근 모양으로 불완전하게 부착된 형태를 나타낸다.(4)  GC-CHO-P1 배지의 경우는 부착된 형태를 보이지만 세포성장은 처음에 보이다가 점차적으로 거의 나타나지 않았다.  하지만 이 실험의 경우, 1% 혈청이 포함된 MEM□ 배지로 자란 세포들의 경우는 세포들이 응집현상을 일으키면서 떠다니고 있었으며 2,3,4,5% 혈청이 포함된 MEM□ 배지로 자란 세포들은 계속 붙어 있었다.  따라서 위의 세포들을 trypsinization 시킨 후 세포수를 결정한 결과, 세포들의 수가 증가한 결과를 얻었다.  따라서 세포의 상태에 따라 GC-CHO-P1 배지만으로도 세포성장이 가능한 것으로 판명되었다.

본 연구는 먼저 고착식 CHO 세포가 부유식 배양이 가능한 지를 살펴보았는데 기본배지로 GC-CHO-P1을 사용하고 5%의 혈청을 첨가한 경우 적응기간 없이 부유식 배양에 성공하였다.  하지만 GC-CHO-P1 배지만으로 배양한 경우는 세포가 성장하지 않았다.  먼저 2.5% 혈청이 포함된 GC-CHO-P1 배지로 부유식 배양에 잘 적응이 되는지를 세가지 실험을 통해 살펴보았는데 미리 T-flask에서 낮은 혈청농도에서 적응을 시킨 후 부유식 배양으로 적응시키는 방법이 세포적응에 보다 효과적인 것으로 나타났다.  앞으로 무단백 배지만을 이용하여 고농도 배양을 할 수 있는 세포주를 확보하기 위해 점차적으로 혈청의 농도를 낮추면서 부유식 배양으로 적응시키는 연구가 진행되어야 할 것이다.

참고문헌

1. Eric Watson, Bhavana Shah, Lisa Leiderman, Yueh-Rong Hsu, Subhash Karkare, Hsieng S. Lu, and Fu-Kuen Lin. (1994) Biotechnology Progress, 10, 39-44

2. Ryoichi Kunitake, Akira Suzuki, Hajime Ichihashi, Shoichi Matsuda, Osamu Hirai, Keiichi Morimoto. (1997) Journal of Biotechnology, 52, 289-294

3. Matthew Shane Croughan, Jean-Francois Hamel, and Daniel I. C. Wang. (1987)  Biotechnology and Bioengineering, 29, 130-141

4. Hyoung-Min Ju, Byung-Gee Kim, Sun-Young Kim, Tae-Han Kim, and Tae-Yong Kim. (1998) Korean Journal of Biotechnology and Bioengineering, 13, 295-302

감사의 글

본 연구는 산업자원부에서 시행한 공업기반기술개발 사업 중 위탁사업으로 수행되었읍니다. 연구비를 지원해 준 산업자원부와 (주)녹십자에게 감사드립니다.  세포주 및 배지를 공급해 준 (주)녹십자의 종합연구소에게 감사드립니다.

Fig. 1. Cell growth in T-flask            Fig. 2. Cell growth in spinner flask

at different serum concentrations          with MEM□(w/ 5% FBS) or

GC-CHO-P1(w/ 5% FBS)

Fig. 3. Cell growth in spinner flask       Fig. 4. Cell growth in spinner flask

with GC-CHO-P1(w/ 2.5% FBS) after     with GC-CHO-P1(w/ 5% & 2.5% FBS)

T-flask with MEM□(w/ 5% FBS)        after T-flask with MEM□(w/ 5% FBS)

Fig. 5. Cell growth in spinner flask       Fig. 6. T-flask culture w/ only GC-CHO

with GC-CHO-P1(w/ 2.5% FBS) after     -P1 after washing with PBS

T-flask with MEM□(w/ 2.5% FBS)