쥐 일차 간세포와 폴리우레탄 폼을 이용한

생물학적 인공간 보조 장치의 간기능 활성도

안 재일, 박 정극

동국대학교 공과대학 화학공학과

Liver Specipic Activities of Bioartificial Liver Support System Using Rat Primary Hepatocytes and Polyurethane Foam

Jae-Il Ahn, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering Dongguk University

서론

간은 체내로 들어오는 독성 물질의 해독과 체내의 다양한 신진대사를 조절하는  필수적인 기관이다. 간은 유해 물질에 가장 먼저 노출되는 환경에 있으면서도 다량의 혈류를 포함하고 왕성한 재생능력을 가지고 있다. 그러나 어떤 원인에 의하여 간세포의 파괴 속도가 재생 속도를 능가하게 되면 간의 괴사로 인한 전격성 간손상으로 진행하게 된다. 최근 급성 간부전 환자나 간이식 대기상태에 있는 환자에 이용하기 위한 체외 인공간 보조 장치에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 인공간의 개발은 최근 조직공학 분야에서 이루어지고 있는데 이것은 다양한 조직을 체외에서 재구성하여 생체내 특성을 그대로 가진 조직으로 분화를 유도, 실제 생체 기능을 갖도록 하는 기술이다(1,2). 인공간은 신장과는 달리 투석막과 같은 장치로 대체할 수 없기 때문에 주로 동물의 간세포를 이용하여 만든다(3).

간세포를 구상체(Spheroid) 형태로 배양하면 단층의 형태로 배양하는 것보다 간세포 기능이 높은 수준으로 장기간 유지된다(4,5). 많은 부착 표면의 제공과 간세포 구상체 형성을 유도하기 위해 폴리우레탄 폼을 사용하기도 하였다(6). 간세포 구상체 형성에 적합한 폴리우레탄 폼을 본 연구실에서 직접 제조하여 폼 내에서 간세포 구상체를 배양해 본 결과 체외 간 보조장치로의 가능성을 보였다(7).

본 연구에서는 폴리우레탄 폼 기공내에 간세포를 접종한 다음 반응기에 충진하여 암모니아 제거, 요소 및 알부민 분비와 같은 체외 순환 인공간 시스템의 간기능 활성을 관찰하였다.

재료 및 방법

폴리우레탄 폼의 제조 및 세척

Polypropylene glycol(M.W.:3000, 동성화학) 1몰당 Crude MDI 9.13몰을 반응시켜 먼저 15%의 NCO잔기를 갖는 프리폴리머를 제조하였다. 반응은 70∼80℃를 유지하면서 Crude MDI에 polypropylene glycol을 조금씩 첨가하여 200rpm으로 4시간 동안 질소하에서 진행하였다. 합성된 15% NCO-프리폴리머에 계면활성제(B-4113, TH. Goldschmidt, Germany)는 1.5%, 촉매(Kao-1, Kao, Japan)는 1.0%, 물은 7.5%를 첨가하여, 5000rpm의 속도로 약 10초동안 교반시킨 후 방치하면 발포된다.

폴리우레탄 폼을 모서리 2-3mm인 직육면체로 자르고 에탄올에 하루동안 방치한 다음 3차 증류수로 세번 세척한다. 두번의 PBS(Phosphate Buffered Saline)세척 후 폴리우레탄 폼의 멸균과 폴리우레탄 폼 내의 기포 제거를 위해 가압 멸균하고 세포 배양 배지로 다시 한번 세척한 후 간세포 접종에 사용하였다.

쥐 간세포의 분리

간세포의 분리는 Seglen-method에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는 데 이는 in situ상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 테크닉으로서 그 방법은 다음과 같다. 180-200g 정도 무게를 갖는 rat을 케타민(0.1mg/rat 100g)과 럼푼(0.01ml/rat 100g)을 주사하여 마취시키고, 해부용 가위를 사용하여 쥐의 복부를 열어 간문맥(portal vein)을 찾아서 catheter를 삽입하고 결찰사로 고정시킨 후 1단계로, calcium-free HEPES 버퍼를 25ml/min의 유속으로 10-15분 흐르게 하여 간을 충분히 세척한다. 2단계로는 0.05%농도의 collagenase가 포함된 완충용액을 20ml/min의 유속으로 10분동안 흐르게 하여 간조직의 기질부분을 느슨하게 분해한다.

효소처리가 끝난 간을 잘라내어 페트리디쉬에 옮긴 후 수술용 메스로 캡슐을 자르고 거즈와 나일론 매쉬에 거른 후 4회의 원심분리(500rpm 2분)로 간세포만 분리한다. 분리된 간세포를 trypan blue dye exclusion 방법과 hemacytometer를 사용하여 세포농도와 생존도를 측정하였다. 보통 2-3×108 개 정도의 세포가 얻어지며 80%이상의 생존도를 갖는다.

폴리우레탄 폼에 간세포 접종 및 반응기 충진

분리된 간세포를 배지 기준으로 부피 1×106 cells/mL의 농도로 60mL의 간세포 용액과 폴리우레탄 폼 10cm3을 spinner flask에서 1시간동안 교반하였다. 1시간의 교반 후 세포 용액의 간세포를 counting 한 결과 9.36×105 cells/cm3 폴리우레탄 폼의 농도로 접종되었다. 간세포가 접종된 폴리우레탄 폼을 부피 20mL인 반응기에 충진, 순환하였다.

체외 순환 인공간 시스템 제작

Figure 1은 본 실험에 제작된 폴리우레탄-인공간 반응기 시스템의 모형도이다. Fresh 배지는 연동 펌프를 거쳐 기체 순환 장치를 통과한 다음 기포 제거 장치에 이르게 된다. 기체 순환 장치에는 계속 산소가 공급된다. 기포 제거 장치를 통과한 배지는 폴리우레탄 인공간 반응기를 거쳐 DO 측정 장치에 이르게 되고 처음의 배지 병에 이르게 되는 시스템이다.

체외 순환 인공간 시스템 운전 조건

순환 line 내의 배지는 45ml이고 총 순환 배지는 100ml이다. 배지 교체는 48시간마다 하였으며 sampling은 1일 1회, DO 측정은 1일 2-3회 측정하였다. Pump의 유속은 0.83ml / min의 유속으로 순환시켰으며 이 속도는 100ml의 총배지가 1일 12바퀴 순환하는 셈이 된다.

체외 순환 인공간 시스템의 간기능 활성도 측정

배양된 간세포의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고, 이에 따른 요소 생성속도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거속도를 측정하기 위해서 배양 3일째부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)법을 사용하였는데, 1차 항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION시약을 사용하였으며, 1차 항체는 2□g/ml를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

Figure 1. Extracorporeal Artificial liver support system

결과 및 토론

체외 순환 인공간 시스템의 간기능 활성도

Figure 2와 3은 각각 암모니아의 제거 속도와 요소 분비 속도를 나타낸 것이다. 1mM의 NH4Cl이 포함된 배지는 구상체가 형성된 후인 3일째부터 첨가하기 시작하였다. 암모니아 제거율이 감소함에도 불구하고 요소 분리율이 높게 유지되는 것은 세포 자체의 대사 과정에서 발생하는 암모니아에서 유래한 요소의 양이 전체 요소 분비량의 상당한 부분을 차지한다는 것을 의미한다.

암모니아 제거 능력은 배양 14일이 지나면 거의 상실되는데 반하여 요소 분비는 배양 15일이 지나도 계속되는데, 이것은 간세포 구상체가 배양 14일이 지나면 외부에서 인위적으로 첨가된 암모니아까지 제거할 능력은 상실되지만 세포 자체의 대사과정에서 발생하는 암모니아는 어느 정도 요소로 전환하는 것으로 생각된다.

Figure 4는 알부민의 분비 속도를 나타낸 것이다. 배양 시간이 흐를 수록 분비량은 감소하지만 상당 기간 동안 알부민이 분비되는 것을 알 수 있었다.

이상의 결과를 볼 때 간세포를 접종한 폴리우레탄 폼을 충진한 인공간 반응기는 체외 간 보조장치로의 개발 가능성을 가지고 있는 것으로 판단된다. 추후 연구는 간기능 활성도를 적어도 2∼3주 동안 초기의 높은 상태로 유지할수 있게 폴리우레탄 폼 내에서의 간세포 접종 방법을 개선하여야 할 것이며 순환 조건을 최적화하여야 할 것이다.

Fig. 2. Change of ammonia removal rate Fig. 3. Change of urea secretion rate            in extracorporeal liver support system       in extracorporeal liver support system

Fig. 4. Change of albumin secretion rate

in extracorporeal liver support system

참고문헌

1. S. M. Edgington, Bio/Technol., Vol. 12, pp. 361-364, 1994.

2. R. Skalak, Proc. The 15th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, pp. 1112-1113, 1993.

3. M. Michio, Artificial Organs, Vol. 10,  No. 3, pp 214-218, 1986.

4. 이재호, 박정극, 최태부, 한국생물공학회지, Vol. 7 No. 4, pp. 278-283, 1992.

5. P. O. Seglen, Meth. Cell. Biol., Vol. 13, pp. 29-83, 1975.

6. T. Matsushita, H. Ijima, N. Koide, and K. Funatsu, Appl. Microbiol Biotechnol, Vol. 36, pp. 324-326, 1991.

7. 안재일, 이두훈, 이윤신, 이재석, 최윤소, 박정극, 의공학회지, Vol. 19, No. 3, pp 215-223, 1998