연속독성탐지 시스템을 이용한 Protein -damage 및 Genotoxicity 탐지

김중현, 길근철, 구만복

광주과학기술원

Detection of protein-damage and genotoxicity

using a continuous toxicity monitoring system

Joong Hyun Kim, Guen Cheoil Kill, Man Bock Gu

Dept. of Env. Sci. & Eng., K-JIST, Kwangju, Korea

서론

강이나 상수원 및 폐수처리장의 생물학적 처리시설로 유입되는 유독성 물질을 탐지하는 방법으로 유전자 재조합된 발광성 대장균을 이용한 독성탐지 방법이 연구되어 지고 있다. 이들 대장균으로  세포내의  유전자나 단백질이  파괴되거나 손상을 입을 때 빛을 발하는 것, 세포의 산화반응이 저해될 경우 빛을 발하는 것들이 개발되어져 있다. 그러나  이러한 재조합된 대장균을 이용 장기간에 걸쳐 연속적으로 독성을  탐지하기 위해서는 재조합 대장균을 유독성 화학물질과의 혼합에도 불구하고 장기간에 걸쳐 성장유지 시킬 수 있고 유독성 화학물질의 유입전후에 따라 재조합 대장균이 발생하는 생물학적 빛을 연속적으로 측정 할 수 있는 장치 및 시스템이 필요하다. 따라서 본 연구에서는  광섬유가 부착된 2단계 소형 생물반응기를 개발하여  생물학적 빛을 발하도록 유전자 재조합된 대장균의 독성물질에 대한 반응특성과 이를 이용한 연속독성탐지를 연구하였다.

이론

Reaction of bioluminescence

박테리아가 발생하는 생물학적 빛은 아래 반응식과  같이  촉매인 luciferase와 molecular oxygen존재 하에 reduced flavin mononucleotide와 long-chain(7-16carbon)fatty aldehyde의 산화 반응의 결과이다.

FMNH2 + RCHO +O2   luciferase    FMN + H2O + RCOOH + hv(490nm)

lux operon은 luxABCDE로 구성되어 있어 luciferase(luxAB)와  aldehyde

합성반응의 촉매로 작용하는 reductase(luxC),transferase(luxD), synthetase(luxE)의 합성에 관여한다.

Mechanism of lux gene expression

아래 그림과 같이 재조합 균주가 외부환경(Radiation, UV, Heat Shock)에 의해 Stress를 받게되면  Stress Promoter가 작동하여 lux gene이 발현됨과 동시에 bioluminescence를 발생한다.

Radiation             Stress Promoter :: lux gene

UV                                                                       Heat Shock                                                    Bioluminescence

Mutagen

Fig1. lux gen의 발현 mechanism

실험방법

Strain, Culture, Medium and Conditions

유전자 재조합된 대장균의 2단계 반응기에서의 유독성 물질에 대한 반응특성을 연구하기 위하여 유전자 재조합된 Bioluminescent E. coil  TV1061, DPD2794를 이용하였다.  재조합 특성은 표와 같다. Luria-Bertani(LB)배지를 사용하였고 멸군하기전에 2N NaOH로 PH를 7.0에 맞추었으며 121OC, 15분간 증기멸군 후  플라즈미드 안정성을 유지하기 위해 25□g/ml의 Kanamycin monosulfate를 첨가하였다.

Seed Culture and Two-stage Minibioreactor Operation

먼저  250ml culture flask에서 30OC, 250rpm의 rotary incubator에서 8시간 배양된 균주를 멸균된 일회용 주사기를 이용하여 1단계 소형생물반응기에 10 %(v/v)을 주입한 후 일정시간 batch상태로 유지시킨 다음 실험하고자 하는 Dilution

rate를 조절하였다.  반응기의 온도는 water bath를 이용하여 30OC로 유지하였으며 산소공급을 위해 1vvm 유속으로 압축공기를  필터를 통해 반응기내로 공급하였다. 2단계 연속독성탐지시스템은 재조합 균주를 성장 유지시키는 1단계 반응기(Working volume=10ml)와 1단계 반응기로부터 유입된 균주와 독성물질을 혼합하는 2단계 반응기(Working volume =20ml)로 구성되어 있다. 각 반응기에는 반응기내의 재조합 균주가 발생하는 생물학적 빛을 빛 측정장치인 luminometer로 전달할 수 있도록 광섬유가 부착되어 있으며  luminometer는 Pentium급 PC와 연결하여   luminometer에서 측정된 값을  LabView를 이용하여 연속적으로 저장하였다. 광섬유부착 소형생물반응기 2단계 연속독성탐지 시스템의 구성도는 그림2와 같다.

결과 및 토론

A Single-Stage Minibioreactor Operation (Working volume=40ml)

DPD2794을 이용 D=0.35/hr, D=0.53/hr, D=0.74/hr, D=1.0/hr 각각에 대해 Mitomycin C 0.1ppm을 Pulse 형태로 주입한 결과 Dilution Rate가  증가하면서 최대 SBL과 최대 SBL도달 시간은 감소하였다.

A Two-Stage Minibioreactor System and Operation

(1st Stage, V=10ml, 2nd Stage V=20ml)

TV1061의 경우 D1=D2=0.83/hr에서 Phenol  100ppm,  300ppm, 700ppm, 1400ppm 에 대해 Pulse 형태로 주입하였을 경우  1400ppm에서 SBL은 감소하다가 1단계 반응기에서 유입되는 재조합 균주로 인해 다시 정상상태에 도달하였다. 이 결과와 같이 2단계 반응기로 구성함으로써 유독성 화학물질의 유입에도 불구하고 독성탐지에 사용되는 재조합 균주를 안정적으로 성장 유지시킬 수 있었다

DPD2794는  D1=D2=0.8/hr에서  Mitomycin C의 농도 5ppb,  50ppb,  500ppb, 5000ppb 각각에 대해 Step형태로 주입하였다. 정상상태에서의 BL(Bioluminescence)는 500ppb까지 증가하였다, 5000ppb에서 BL은 주입후 250분이 경과한 후 최대 값을 나타낸 후 감소하였으며 Mitomycin C 주입을 중지하자 다시 BL이 증가하다 Mitomycin C 주입전의 BL로 다시 되돌아갔다 이는 5ppm Mitomycin C에 의해 DPD2794의 성장이 저해되어 BL값이 감소했다가 1단계 반응기에서 새로   유입된 균주로 인해 다시 BL이 회복된 결과로 생각된다.

이상의 실험결과에서 보듯이 광섬유가 부착된 소형생물반응기를 2단계로 구성하여 독성을 연속적으로 탐지함으로써  유독성물질의 유입에도 불구하고 독성탐지에 이용되는 재조합 균주를 안정적으로 성장 유시킬 수 있어 연속독성탐지를 성공적으로 수행할 수 있었다. 또한 이 시스템은  부피가 매우 작으므로 균주의 성장에 필요한 배지의 소모량이 작아 운전비가 작게 들고 운전이 용이하다. 특히 DNA damage를 입을 경우 빛을 발하도록 재조합된 DPD2794는 Mitomycin C 의 넓은 농도에 걸쳐 민감하게 반응하며  정량적인 분석도 가능하다.

표1. 유전자 재조합된 E.Coil의 종류와 특성

Strain	Plasmid/Host	Phenotype
TV1061	pGreBLux6/RFM443	KanR, AmpR, luminescent Heat-Shock Response
DPD2794	pRecALux6/RFM443	KanR, AmpR, luminescent DNA-damage sensitive

PC                    유독성 화학물질                                                                                                                   LB배지

waste     Luminometer

Fig2. 광섬유부착 2단계  소형생물반응기를 이용한  연속독성탐지 시스템의 구성도

Fig4. TV1061의 D=0.46/hr에서 300ppm Phenol           Fig5. DPD2794의 D1=D2=0.8/hr에서 5ppb Mitomycin C

Pulse 주입에 따른 반응특성                                  Step 주입에 따른 반응특성

참고문헌

1. Van Dyk, T. K., Majarian, W. R., and LaRossa, R. A., Rapid and sensitive pollitant detection of heat-shock gene-bioluminescence gene fusion, Apple. Environ. Microbial.,  1994, 60, 1441-1420

2. Rupani, S. P., Man Bock Gu, Konstantinov, Van Dyk, T. K. and LaRossa, R. A., Charaterization of the Stress Response of a Biological Sence of in Batch and Continuos Cultures, Biotechnol. Prog., 1996, 12, 387-392.

3. Man Bock Gu, Dhurjarti, P. S., Van Dyk, T. K and LaRossa, R. A., A Miniature Bioreactor for Sensing Toxicity Using Recombinant Bioluminescence Escherchia coil Cells, Biotechnol, Prog., 1996, 12,393-397.

4. Meighen, E. A., Molecular biology of bacterial bioluminescence, Microbioal. Rev, 1991, 1233-142