Dibenzothiophene의 분해를 위한 재조합 미생물의 개발

박시재, 정기준, 이현숙, 이상엽, 장용근

대전광역시 유성구 구성동 373-1 한국과학기술원 화학공학과 및 생물공정연구센터

Development of Recombinant Bacteria for the Degradation of Dibenzothiophene

Si Jae Park, Ki Jun Jeong,

Hyun Sook Lee, Sang Yup Lee, and Yong Keun Chang

Department of Chemical Engineering and BioProcess Engineering Research Center, KAIST 373-1 Kusong-dong, Yusong-gu, Taejon 305-701

서론

석유나 석탄에는 200가지 이상의 유기황 화합물이 존재한다. 이 황성분들은 연소될 때 많은 환경문제를 야기하고 물리적, 화학적 방법으로 제거하기가 힘들다. 기존의 촉매를 이용한 탈황공정은 복잡한 구조를 가지는 유기황 화합물을 제거하는데 효과적이지 못하기 때문에 이것을 대체할 방법으로 미생물을 이용한 탈황방법이 제안되었다. 미생물 탈황연구에서 모델화합물로 주로 사용되는 물질은 Dibenzothiophene (DBT)이고, 원유에 포함되어 있는 유기황 중에서 약 30-60%까지 차지한다고 알려져 있다. DBT는 구조가 복잡해서 기존의 공정으로 제거하기가 어렵다. 지금까지 많은 미생물이 원유나 석탄에 포함되어 있는 유기황을 분해한다고 알려져 있으며 특히 그람양성균인 Rodococcus sp. IGST8은 DBT의 탄소와 황의 결합을 선택적으로 끊어 황을 제거하여 원유의 caloric value를 떨어뜨리지 않는 장점을 가진다. IGTS8은 DBT로부터 황을 제거하고 마지막 생산물로 물에 용해되는 2-hydroxybiphenyl (2-HBP)를 만든다. Denome 등에 의해 최근에 IGTS8로부터 탈황에 관련된 유전자가 클로닝되었고 특성이 연구되었다. 이 탈황유전자는 soxA, soxB, soxC로 구성되어 있고 하나의 오페론 (operon)으로 작용한다. 탈황유전자 soxABC는 lac promoter의 제어하에 Escherichia.coli에서 발현되었으며 이 유전자를 가진 재조합 E.coli은 DBT를 2-HBP로 전환하는 탈황능을 보였다. 본 연구의 목적은 효과적인 DBT의 분해를 위한 재조합 미생물을 개발하는 것이다.

실험

Bacterial strains, plasmids, and growth condition

E.coli XL1-Blue, Klebsiella oxytoca A23-3, Rhodococcus sp. UV1이 발현균주로 사용되었다. Klebsiella oxytoca A23-3는 DBT를 분해할 수 있는 균주로 원유 오염 토양에서 분리되었으나 2-HBP는 생산하지 못했다. Rhodococcus sp. UV1은 IGTS8의 돌연변이로서 탈황능을 잃어버린 균주이다. K. Young으로부터 얻은 soxABC를 가진 플라스미드 pSAD225-32와 pSAD104-10이 사용되었으며 pSAD104-10은 Rhodococcus. pKG1022에서 작용하는 오리진을 가지고 있고 플라스미드 R1의 parB (hok/sok)를 포함하고 있기 때문에 플라스미드를 잃어버린 균을 죽여 플라스미드 안정성을 높인다.

균은 LB배지 (tryptone, 10 g/L; yeast extract, 5 g/L; NaCl, 10 g/L), 30℃에서 배양되었으며 탈황능을 측정하기 위하여 BSM 배지 (glycerol, 2 g/L; NaH2PO4·H2O, 4 g/L; K2HPO4·3H2O, 4 g/L; NH4Cl, 2 g/L; MgCl2·6H2O, 0.2 g/L; CaCl2·2H2O, 0.001 g/L; FeCl3·6H2O, 0.001 g/L)를 사용했다. Casamino acid (0.1 g/L)와 thiamine (5 □g/mL)이 BSM배지에 필요할 때 첨가되었다. Ampicillin (Ap), tetracycline (Tc), kanamycin (Km)이 각각 50, 12.5, 25□g/mL의 농도로 필요할 때 첨가되었다.

Eatimation of plasmid stability in Escherichia. coli

균은 연속적으로 LB배지 10 mL에 계대배양 되었다. OD600 값이 1 정도 되었을 때 Ap가 없는 새로운 LB 배지에 적당한 양만큼 다시 접종되었다. 접종 전에 균을 적당히 희석시킨 다음 Ap가 있는 plate와 없는 plaste에 각각 spreading했다. 플라스미드 안정성은 Ap가 없는 plaste에서 나온 colony와 Ap가 있는 plate에서 나온 colony 개수를 비교하여 적어도 세 번이상 측정되었다.

Assay of desulfurization activity

배양된 균을 30℃, LB배지에서 키운 다음, 원심분리를 통해 모았다. 모은 균체를 BSM배지로 씻은 다음 50이나 250□mole (dissolved in 5 mL of hexadecane)의 DBT가 포함되어 있는 50mL BSM배지에 옮겼다. 30℃에서 3일 동안 배양한 다음 2시간 동안 상온에서 50 ml hexadecane으로 추출했다. 상층액을 70% acetonitrile을 mobile phase로 사용하여 Nova-Pak C18 (3.9×150 mm)이 장착되어 있는 reverse-phase HPLC로 분석했다. 전환률은 DBT mole당 생성된 2-HBP의 mole 비로 정의했다.

결과 및 토의

플라스미드 pSAD225-32 는 Rhodococcus sp. IGTS8의 soxABC유전자를 가지고 있다. E.coli에서 플라스미드 안정성을 높이기 위해 pKG1022의 parB를 클로닝하여 pSAD225-32로부터 pJKJ101 과 pJKJ102를 만들었다. E.coli XL1-Blue에서 pJKJ102는 120 generation동안 안정하게 유지되었다. (그림 1) 그러나 pSAD225-32는 60 generation부터 불안정하기 시작했고 120 generation 후에 플라스미드를 함유하고 있는 균의 비율은 35%이하였다. 우리는 최근에 DBT를 분해할 수 있는 능력을 가진 K. oxytoca A23-3을 분리했다. 탈황능을 증진시킨 재조합  K. oxytoca를 만들기 위해 플라스미드 pJKJ101을 electroporation를 이용해 K. oxytoca 에 넣었다. 탈황능 분석은 E.coli XL1-Blue (pSAD225-32), E.coli XL1-Blue (pJKJ102), K. oxytoca A23-3 (pJKJ101), 그리고 Rodococcus sp. UV1 (pSAD104-10)를 가지고 실행했다.  Rodococcus sp. UV1 (pSAD104-10)이 가장 좋은 효율 (10-32%)로 DBT를 2-HBP로 전환했다. pSAD225-32나 pJKJ102를 가지고 있는 E.coli은 Rodococcus 보다 낮은 효율을 보였다.(03-1.3%) K. oxytoca A23-3 (pJKJ101)의 전환효율은 0.7-2.4%였다. 네가지 재조합 균주들에 대해 초기의 DBT농도가 낮을 때 DBT전환효율은 높았다. 재조합 E.coli나 재조합 K. oxytoca에서 탈황능이 낮게 나온 이유는 그람양성균으로부터 클로닝된 soxABC의 translation이 비효율적으로 되었기 때문으로 보인다. 재조합 E.coli나 재조합 K. oxytoca에서 플라스미드의 안정성 또한 낮았다.  재조합 Rodococcus sp를 이용하는 것이 효율적으로 DBT를 분해하는 방법으로 사료된다. 더 증진된 탈황능은 Rodococcus의 탈황능을 잃어버린 돌연변이를 숙주로 이용하기 보단 wild type Rodococcus를 숙주로 이용하여 homologous 나 heterologous 증폭을 이용하는 것으로 가능해 보인다.

그림1. Plasmid stability of pSAD225-32 and pJKJ102 in E. coli XL1-Blue during the repeated subculturing in the absence of antibiotics for 120 generations.

표1. Desulfurization of DBT by four recombinant bacterial strains.

Recombinant strains	substrate DBT (mole)	2-HBP production (mole)	Conversion efficiency (%)
E. coli XL1-Blue (pSAD225-32)	50	0.59	1.18
	250	0.77	0.31
E. coli XL1-Blue (pJKJ102)	50	0.67	1.34
	250	0.89	0.35
K. oxytoca A23-3 (pJKJ101)	50	1.2	2.40
	250	1.9	0.76
Rhodococcus sp. UV1 (pSAD104-10)	50	16	32.0
	250	28	11.2

참고문헌

1. Monticello, D. J. and W. R. Finnerty, Ann. Rev. Microbiol. 39, 371(1985).

2. Denome, S. A., E. S. olson and K. D. Young. Appl. Environ. Microbiol. 59, 2837(1993).

3. Denome, S. A., C. Oldfield, L. J. Nash and K. D. Young. J. Bacteriol. 176, 6707(1994).

4. Bullock, W. O., J. M. Femandez and J. M. Stuart. BioTechniques. 5, 376(1987).

5. Sohn, H. Y., J. H. Chang, Y. K. CHANG, H. N. Chang, H. W. Ryu and K. S. Cho. Clean. Technol. (in korean) 2, 53(1996).

6. Gerdes, K. Bio/Technology. 6, 1402(1988).