섬유소계 폐기물로부터 cellulase 생산을 위한

최적 배양조건의 확립

고은화, 강성우*,이진석**,김승욱

고려대학교 화학공학과, 고려대학교 생명공학원*,

한국 에너지 기술연구소**

Establishment of culture conditions for the production of cellulase from lignocellulosic biomass

Eun Hwa Ko, Sung Woo Kang*, Jin Suk Lee** and Seung Wook Kim

Department of Chemical Engineering, Korea University

Graduate School of Biotechnology, Korea University*

Korea Institute of Energy Research**

서론

Cellulase는 식품, 사료첨가제, 세제, 섬유가공 약품 등의 첨가제로서 상업화가 급속히 진행되고 있다. 따라서 cellulase를 경제적으로 생산하는 공정을 개발하기 위해 수많은 연구기관과 회사들이 시도하였지만 외국의 몇몇 회사들만이 cellulase의 상업화에 성공하고 있다. 국내에서의 cellulase 생산은 정제배지를 사용하여 극히 일부 분야에 사용하고 있고, 대부분은 수입에 의존하고 있다. 국내외를 막론하고 기질을 lactose와 같은 값비싼 물질을 이용하기 때문에 경제성에 있어 문제가 되며, 이를 섬유소계 폐기물과 같은 값싼 기질로 대체한다면 수입대체 효과가 있을 뿐 아니라 국내산업의 다양한 분야에 쉽게 이용될 수 있을 것이다.

본 연구의 목적은 볏짚, 겨, 간벌재와 같은 값싼 섬유소계 폐기물로부터 □-glucosidase 생산균주인 Aspergillus niger와 exo-glucanase, endo-glucanase 생산균주인 Trichoderma reesei를 이용하여 우수균주를 선별하고, 효소의 생산을 극대화할수 있는 배양조건을 확립하는데 있다.

실험재료 및 방법

□-Glucosidase을 생산하기 위해 모균주인 Aspergillus niger KKS의 변이주인 KK2와 cellulase 생산균주인 Trichoderma reesei RUT C-30 변이주를 사용하였다.

A. niger KK2의 종균배지로는 2% malt extract broth를 사용하였고, 생산배지로는  2% lignocellulosic waste, 1% wheat bran, 0.5% proteose peptone, 0.5% KH2PO4, 0.05% yeast extract, 0.01% COSO4.7H2O, 0.05% CuSO4.5H2O를, T. reesei RUT C-30은 1% lignocellulosic waste, 1.2% (NH4)2SO4, 0.3% peptone, 0.35% KH2PO4, 0.03% MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 0.2□ Tween 80, trace element solution을 생산배지로 하였다. A. niger KK2를 이용한 □-glucosidase 생산에 대한 탄소원의 영향은 250□ 삼각 플라스크에 10%(V/V)의 접종량을 포함한 50□의 생산배지에 탄소원을 달리하여 실험하였다. 효소활성의 측정은 0.05M citrate buffer (pH 4.8)에 1mM p-nitrophenyl-□-D-glucopyranoside 용액 0.9□에 0.1□의 희석된 시료용액을 넣고, 50℃ 또는 60℃에서 20분간 반응시킨 후 1M Na2CO3 용액 1□를 넣어 반응을 정지시켜 400□에서 흡광도를 측정하여 유리된 p-nitrophenol의 양을 측정하였다.

T. reesei의 경우 발효조 배양 (3.0□,배지 2.0□)은 시험 탄소원을 1∼ 2%넣고30℃, 교반속도 300rpm, 통기량 0.3vvm,상압과 1.2□/□의 가압조건으로 배양하였다. 시험균주는 lactose를 탄소원으로 한 배양조건으로 48시간 배양한 것을 10% (V/V) 접종하였다. 신문지를 ball mill로 미세 분쇄한 것과 윌러 mill로 거칠게 분쇄한 것, 사무용지를 cutting mill로 분쇄한 것 및 이들을 효소당화하고 원심분리하여 얻은 당화잔사와 수용성 물질을 제거하기 위하여 이들을 원심분리방법으로 수회 세척한 세척당화잔사를 기질로 하여 T. reesei Rut C-30균주를 플라스크 배양하고 cellulase활성을 측정하였다. cellulase 활성의 측정은 IUPAC 방법에 준하며, 효소활성 단위는 1분간에 1□mol의 glucose를 생성하는데 필요한 효소량(IU)으로 나타내었다. 환원당은 DNS법으로 측정하였다.

결과 및 토론

고생산성 균주개발

□-Glucosidase 고생산성 균주를 선별하기 위해 모균주인 A. niger KKS를 NTG와 □-ray 처리하여 A. niger KM을 선별하였으며, UV 돌연변이에 의해 A. niger KK1이 선별되었으며, KK1을□-ray 처리하여 효소활성이 우수한 A.niger KK2가 선별되었다. 한편 cellulase 역가가 높은 변이주를 선별하기 위해 T. reesei RUT C-30 균주의 현탁포자액에 NTG와 UV를 동시에 처리하여 우수변이주인 25-2-1과 25-3-5의 cellulase 생산성을 비교실험한 결과 모균주에 비해 filter paper 분해활성이 약 2.1배와 1.6배 가량 높았다. 그러나 기존의 보고된 변이주들과 마찬가지로 안정성이 떨어져 수 개월 후에는 catabolite repressor resistance 능력을 상실하여 실제 cellulase 생산균주로 활용하는 문제가 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 모균주인 RUT C-30을 향후 연구에 사용하였다.

배양조건의 확립

생산 배지의 초기 pH의 영향을 실험하기 위해 phosphate, citrate, acetate buffer, NaOH를 이용한 초기 pH를 4.0∼ 8.0범위로 변화시켜 효소활성에 미치는 영향을 비교한 결과 효소활성은 NaOH를 이용한 초기 pH 7.0에서 3.25 IU/□에서 좋은 결과가 나타났다. 그러나 NaOH와 acetate buffer를 이용한 초기  pH 4.0에서는 각각 50%, 100%로 감소하였으며 citrate buffer에서는 10∼ 30% 효소활성이 감소하였다. 나무칲 폭쇄재를 당화하고 남은 slurry를 건조 분쇄한 목질 폐기물과 신문지를 당화하고 남은 slurry를 건조 분쇄한 신문지 폐기물, 그리고 ball mill로 미세 분쇄한 볏짚을 1∼ 4%의 농도를 변화시켜 A.niger KK2를 7일간 배양후 효소활성을 비교한 결과 기질의 최적농도는 목질계 폐기물, 신문지 폐기물, 볏짚이 각각 3, 3, 2%로 나타났으며, 최대활성은 각각 2.67, 3.31, 3.27 IU/□였다(Fig. 1). 효소의 최적 pH와 온도는 pH 4.8, 60℃로 기존의 효소활성 최적조건인 pH 4.8, 50℃에서보다 약 2배 증가하였다 이 같은 결과는 선별된 변이주는 모균주에 비해 고온에서 높은 효소 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

A. niger KK2와 기존의 보고된 □-glucosidase 고생산성 곰팡이 균주간의 최대 수율을 비교한 결과 Aspergillus ustus와 Fusarium oxysporum이 각각 245 U/g straw, 232 U/g straw이었지만, 본 연구에서 개량된 A. niger KK2 변이주는 이들보다 최대수율이 2배 이상 높아 □-glucosidase 생산을 위한 아주 우수한 균주임이 증명되었다. 특히 신문지와 볏짚의 경우 각각 500 U/g straw, 570 U/g straw로 나타났다(Table 1). 이외에도 FPA(Filter paper activity)와 CMCase(Carboxylmethylcellulase)의 최대 효소활성의 볏짚에서 배양했을 때 각각 0.7, 4.0 IU/□이었으며, 특히 hemicellulase인 xylanase와 □-xylosidase 활성이 각각 500, 25.0 IU/□로 아주 우수하여 hemicellulose 분해를 위한 효소공급원으로 큰 잠재력을 갖고있음을 보여 주었다(data not shown).

T. reesei RUT C-30균주를 플라스크 배양하고 cellulase 활성을 측정해볼 때 시험 탄소원 중 사무용지 당화잔사와 이것을 세척하여 수용성 물질을 제거한 기질이 FPase 활성이 각각 1.93, 1.97 IU/□로 가장 높았고, 다음으로 나무칩 당화잔사와 1.72 IU/□였다 여러 가지 목질계 탄소원 중 당화잔사가 우량한 cellulase 생산기질로 인정되었고 그의 적합한 첨가량을 결정하기 위해 각각 1∼3%첨가한 Vogel 배지에서의 효소 생산을 검토하였다. 시험기질 모두 2% 첨가한 경우가 효소활성이 높았고 적합 첨가랑으로 인정되었다. 플라스크 배양에서 cellulase 생산 기질로서 유망한 것으로 검토된 사무용지 당화잔사와 폭쇄재 당화잔사를 각각 2% 첨가한 배지에 대해서 시험균을 발효조 배양을 하였다. 최대활성은 사무용지 당화잔사를 탄소원으로 한 경우가 0.872 , 폭쇄재 당화잔사의 경우가 0.99 IU/□로 나타났다(Fig. 2). 현재까지의 실험결과로 볼 때, 플라스크 배양에서 사무용지 당화잔사 및 폭쇄재 당화잔사가 값이 싸고 cellulase 생산성이 높은 기질로 검토되었다.

Table 1. Comparison of maximum yield □-glucosidase A. niger

Fungus             Wheat Straw  Maximum

Yield            Reference

(%,w/v)   (U/g straw)

Alternaria alternata         2.0     48.5         Macris et al., 1988

Aspergillus ustus           2.0     245.0        Macris and Kekos, 1989

Penicillum funiculosum      1.0     80.0         Hoffman and Wood, 1985

Sporotrichum thermophile    1.0     60.0         Sugden and Bhat, 1994

Telaromyces emersonii       4.5    12.2         Maloney et al., 1983

Trichoderma harzianum      2.0    145.0        Macris and Kekos, 1989

Fusarium oxysporum        2.0    52.2        Christakopoulos et al., 1995

Fusarium oxysporum       2.0(a)  232.0       Christakopoulos et al., 1995

Aspergillus niger KK2      2.0(b)  500.0        This work

Aspergillus niger KK2       2.0(c)  570.0        This work

Aspergillus niger KK2       2.0(d)  322.0        This work

(a)Wheat bran (b)Rice straw (c)Paper waste (d)Wood waste

Fig.2. Cultivation of T. reesei RUT C-30 with office paper hydrolysates slurry & exploded wood hydrolysates slurry in the bioreactor

참고문헌

1. Kang S. W., Kim S. W. and Kim K. J. : Microbiol. Biotechnol., 4,                  49 (1994).

2.  Kim S. W., Moon K. H. and Tae B. S. : Biotechnol. Tech., 10, 735 (1996).

3. Macris B. J., Paspaliari M., and Kehos D. : Biotechnol. Lett., 7, 369                 (1988).

4.  Miller, G. L., A Qnal. Chem., 31, 426 (1959).