Molecular Imprinting기법을 이용한 (S)-(+)-Ibuprofen분리용

인공 Receptor제조

신명근, 조규헌, 송인규*

강원대학교 화학공학과, 강릉대학교 공업화학과*

Preparation of Artificial Receptor for The Separation of (S)-(+)-Ibuprofen Using Molecular Imprinting Technique

Myoung Keun Shin, Gyu Heon Cho, In Kyu Song*

Dept. of Chemical Engineering, Kangwon National University

Dept. of Industrial Chemistry, Kangnung National University*

서론

일반적으로 약효를 보이는 약용물질들은 라세믹 혼합물로 이루어 진 것이 많다.  이러한 라세믹 성분들은  체내에서 서로 다르게 작용하며 이들 중 하나는 약효가 없거나 또는 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다.  따라서 이러한 두 enantiomer를 순수한 물질로 분리하는 것은 필수적이며, 특히 미국의 경우 FDA(Food and Drug Administration)의 규정이 점점 엄격화되면서 광학적으로 순수한 물질을 얻는 것은 매우 중요한 과제가 되었다.[1].  지금까지 알려진 광학적 분리방법으로는 두 enantiomer중 한 성분을 선택적으로 분해시키는 미생물이나 효소를 이용하는 방법, 부분결정법(fractional crystallization), chiral 고정상을 이용한 HPLC법 등이 있다.  이중 크로마토그래피 기술이 종종 유용하게 사용되기도 하지만, 새로운 광학적 이성질체에 대해 선택성을 가지는 고정상을 새롭게 찾는 것은 쉽지 않다.  또한, 상품화되어 있는 chiral 고정상은 충분한 용해도를 가지고 있지 않거나 매우 비싸다는 큰 단점을 가지고 있다.  이에 대해 크로마토그래피 분리법에서 molecularly imprinted polymers(이하 MIPs라고 함)를 고정상으로 이용하여 목적물질을 선택적으로 흡착하려는 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이론

Molecular imprinting은 특정분자에 대한 선택성을 가지는 고분자를 제조하는 기술로써, 이렇게 제조된 고분자에는 특정분자가 선택적으로 흡착된다.  Molecular imprinting공정의 개략도는 Fig. 1에 나타내었다.  여기에서 보는 바와 같이 molecular imprinting은 크게 3단계로 이루어진다.  첫째로, template 또는 print molecule이라 불리는 목적분자(target molecules)와 고분자 단량체(monomer)사이에 약하면서도 가역적인 상호작용이 형성되게 된다.  그후 이 template와 고분자 단량체(monomer)의 복합체를 다량의 가교제와 함께 중합을 하게 된다.  중합이 끝난 후 template를 고분자로부터 추출하면, 고분자 matrix안에는 template의 모양이 기억되고 template와 상호 작용할 수 있는 작용기가 남게 된다.  고분자 내부의 이러한 특정 분자에 대해 선택성을 갖는 작용기와 기공의 모양은 목적분자에 대해 높은 선택도를 지니게 한다.

본 연구에서는 molecular imprinting 기술을 이용하여 항염증제로 널리 사용되는 (S)-(+)-ibuprofen에 대해 선택성을 지니는 인공 receptor를 제조하고자 하였다.

실험

1. Artificial Receptor의 제조

각 MIPs를 만들기 위해 고분자 단량체(monomer)와 가교제(crosslinker), template의 비를 16 : 80 : 1 로 하였다. Monomer로는 methacrylic acid(MAA)와 4-Vinylpyridine(4VPy)을, crosslinker로는 ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA)를 사용하였다.  각 물질의 조성에 따라 중합용액을 반응기에 넣은 뒤, 중합을 시키기 전에 질소를 5분간 불어넣어 라디칼 반응을 유도하였다.  중합은 40℃의 열 중합과 UV(366nm)중합으로 이루어졌다. 이렇게 제조된  고분자 덩어리를 mortar로 분쇄한 뒤, 채를 이용하여 25-46□m 크기의 입자만을 선택하였다.  또한, acetonitrile에 20분동안 침전시켰고, template를 제거하기 위해 에탄올로 24시간 동안 soxhlet 추출을 하였다.  이렇게 제조된 MIPs를 오븐에 건조시킨 뒤, desicator에 보관하였으며, 제조된 MIPs의 성능을 비교조사 하기 위해 조성은 같으나 template를 넣지 않는 control 고분자도 함께 제조하였다.

2. Batch Binding

일정량의 제조된 인공 receptor와 농도를 알고 있는 (S)-(+)-ibuprofen용액을 균일하게 혼합시키는 후 일정시간 평형에 도달하게 반응시킨 후 액상부분만을 분리하여 HPLC(KNAUER, Germany)로 분석하였다.  분석조건은 다음과 같다.

Column          : Knauer LC-18 (30cm L×4.6mm ID)

Detector         : UV detector(215nm)

Mobile phase     : 7mM H3PO4 + acetonitrile (1:1)

Flow rate        : 1.0 mL/min

Sample size      : 20□L

Internal standard : 4-tert-butylbenzoic acid

3. Scatchard Analysis

Drug-receptor 상호작용모델은 specific reversible binding을 설명하는데 유용하게 이용되어지고 있다[2].  일반적 Scatchard analysis에 관한 식은 다음과 같다.

[eqn: r over (X)~ =~ {-r over K_D ~}+{~ n over K_D}]

여기서 r은 총 receptor당 결합된 drug의 몰, (X)는 평형상태에서 free drug의 농도, n은 총 결합점(binding sites)수, KD는 해리상수 이다.  위 식을 r/(X) 와 r에 대해 plot하면 KD값을 얻을 수 있다. 이러한 scatchard polt는 affinity의 종류에 따른 binding site집합체의 개수에 대한 정보를 제공하여 준다. 따라서 본 실험에서 제조된 인공 receptor의 결합점(binding sites)의 성질을 규명하기 위해 MIPs 50mg과 0.1mM에서 20mM까지 다양한 (S)-(+)-ibuprofen 용액을 섞어서 결합 실험을 하였다.  평형에 이를 때까지 상온에서 교반시킨 뒤 상등액을 채취하여 batch binding 실험의 분석 조건으로 분석하였다.

결과 및 토의

1. Binding Kinetics연구

Binding kinetics를 조사한 결과 반응이 15분 이내에 종결되는 것을 볼 수 있었다.  이것은 batch binding을 통해 반응시간을 측정한 결과 1시간내에 평형에 도달한다고 보고와 비교할 수 있다[3].

2. 중합조건 및 고분자 단량체(monomer)종류의 영향

Fig. 2에서 보는 바와 같이 -20℃에서 UV중합한 4VPy-MIPs가 20℃에서 UV중합한 4VPy-MIPs보다 약 1.3배 (S)-(+)-ibuprofen을 더 흡착시켰다.  이는 중합반응 온도가 낮을수록 고분자 단량체와 template 사이에 사전 배열이 더 잘 일어나 인식능이 증가하기 때문인 것으로 사료된다[4].

20℃에서 UV중합을 한 4VPy-MIPs가 MAA-MIPs보다 (S)-(+)-ibuprofen을 1.2배 가량 더 흡착 시켰으며, 이는 template와 MIPs와의 상호작용의 세기에 기인하는 것으로 추론된다.  20℃에서 UV중합한 MAA-MIPs가 40℃에서 열 중합한 MAA-MIPs보다 1.9배 가량 더 흡착시키는 것을 통해 UV중합이 열중합보다 우수함을 알 수 있다.

3. Scatchard Analysis

제조된 MIPs의 결합점(binding sites)의 성질을 규명하기 위해 Scatchard analysis를 수행하였다. -20℃에서 중합한 4VPy-MIPs 50mg과 0.1mM, 1.0mM, 2.0mM, 5.0mM, 10.0mM, 20mM의 (S)-(+)-ibuprofen, (±-)-ibuprofen, ketoprofen 용액울 각각 2mL씩 시험관에 넣고 평형에 이르게 한 뒤, 액상부분을 채취하여 분석하였다. (S)-(+)-ibuprofen의 경우 Fig. 3에서 보는 바와 같이 흡착되는 (S)-(+)-ibuprofen의 양이 고농도의 (S)-(+)-ibuprofen부근에서 포화곡선을 나타냄을 알 수 있었다.   또한, 이렇게 얻은 결과를 binding sites의 수 n과 해리상수 KD를 구하기 위해  Scatchard plot을 그렸다.  전형적인 흡착공정에 의하면 receptor의 결합점(binding sites)이 균일한 친화도를 가지므로 한 개의 직선이 그려지게 된다.  그러나 본 실험에서는 그림에서 보는 바와 같이 2개의 직선이 그려지는 것을 통해 친화도가 서로 다른 2 종류의 결합점(binding sites)이 존재함을 추론할 수 있다.  이는 각각 MIPs내 기공의 형태와 작용기에 의한 specific binding sites와 고분자 network에 의한 non-specific binding sites로 사료된다.  이러한 가정하에 제조된 4VPy-MIPs의 (S)-(+)-ibuprofen에 대한 specific binding sites, n은  4.9□mol/g, non-specific binding sites는 12.0□mol/g이고, 해리상수 KD는 각각 0.68mM, 3.78mM로 계산되었다.

(S)-(+)-ibuprofen과 화학적 구조가 비슷한 ketoprofen을 이용하여 Scatchard analysis실험을 수행하였다.  그 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 1개의 직선이 그려졌으며 이를 통해 ketoprofen은 제조된 (S)-(+)-ibuprofen-imprinted polymers에 대해 1종류의 binding sites에만 흡착함을 알 수 있었다.  제조된 인공 receptor에 대한 (S)-(+)-ibuprofen과 ketoprofen의 성질이 서로 다른 binding sites의 종류와 binding strength의 차이는 본 실험에서 제조한 MIPs를 HPLC 고정상으로 사용하였을 때, ibuprofen과 화학구조가 다른 물질간에 분리가 일어날 수 있는 가능성을 제공하여 준다.

Non-specific binding sites에 대한 specific binding sites의 비율을 구하였을 때, (S)-(+)-ibuprofen에 대해서는 0.40인 반면, (±)-ibuprofen에 대해서는 0.27로 계산되었다.  이는 본 실험에서 제조한 인공 receptor가  (R)-(-)-ibuprofen에 대한 specific binding sites보다 (S)-(+)-ibuprofen에 대한 specific binding sites를 더 많이 지니고 있음을 보여준다.  이러한 결과는 본 실험에서 제조한 receptor를 HPLC chiral 고정상으로 사용하였을 때, (S)-(+)-ibuprofen과 (R)-(-)-ibuprofen간에 분리가 일어날 수 있는 가능성을  제시하여 준다.

참고문헌

[1] I. Wainer and D. Drayer, "Drug Stereochemistry: Analytical Method and   Pharmacology", Marcel Dekker press, p209-225(1988)

[2] Matsui J., Miyoshi Y., Doblhoff-Dier O. and Takeuchi T., Anal. Chem, 67, 4404(1995)

[3] Sellergren B., J. Org. Chem., 55, 3381(1990)

[4] Muller R., Andersson I. and Mosbach K., Makromol. Chem,, Rapid Commun., 14, 637(1993)

Table 1. Binding sites(n) and dissociation constants(KD) obtained from Scatchard analysis.

	Specific biding		Non-specific binding		Ratio of Specific/ non-specific binding sites
	n [□mol/g]	KD [mM]	n [□mol/g]	KD [mM]
(S)-(+)-ibuprofen	4.9	0.68	12.0	3.78	0.40
(±)-ibuprofen	4.3	0.61	16.2	5.64	0.27
ketoprofen	--	--	15.1	1.80

Fig. 2. The batch binding of (S)-(+)- ibuprofen with various MIPs.

Fig 1. The schematic represen- tation of molecular Imprinting.

Figure . (A) Binding isoterm of (S)-(+)-ibuprofen imprinted polymers with (S)-(+)-ibuprofen  (B) Scatchard plots.

Figure  . (A) Binding isotherm of (S)-(+)-ibuprofen imprinted polymers with ketoprofen solution. (B) Scatchard plots.