초임계 CO2를 이용한 Cyclodextrin의 생성과

Cyclodextrin Glucanotransferase의 작용 Mechanism

고 은용, 박 창렬*, 유 연우*, 김 철

아주대학교 화학공학과, 아주대학교 생물공학과*

Production of Cyclodextrins and its Reaction Mechanism

in Supercritical Carbon Dioxide

Eun Yong Ko, Chang Yeol Park, Yeon Woo Ryu* and Chul Kim

Department of Chemical Engineering and Department of Biotechnology*, College of Engineering, Ajou University, Suwon 442-749, Korea.

서 론

Cyclodextrin은 amylase 계통의 효소인 cyclodextrin glucano-transferase (CGTase)를 전분에 작용시켜 glucose 분자가 □-1,4-glucoside 결합에 의해 환상으로 연결된 비환원성의 malto oligosaccharide로 glucose 분자 수에 따라 □(6개)-, □(7개)-, □(8개)-cyclodextrin의 세 종류로 구분된다. Cyclodextrin 분자중의 동공이 소수성을 외부가 침수성을 나타내는 특이한 분자 구조를 나타내서 분자 내부에 여러 가지 유용한 유기, 무기 화합물질을 포접하여 휘발성 물질의 안정화, 산화방지, 광분해 물질의 보호, 용해도의 향상과 같은 여러 가지 물질 개선 효과가 있어서 식품, 의약품, 농약 등 다방면에 유용하게 활용할 수 있는 기능성 탄수화물계 생물 신소재이다[1-3].

초임계 유체는 기체상과 같은 낮은 점성과 높은 확산성으로 기질에서 효소로의 물질전달 속도를 높여 주고, 액체상과 같은 밀도로 기체상에서 관찰된 것보다 더 높은 용해도를 가진다. 일반적인 전분의 효소가수분해 반응은 반응시간이 길며 이차산물에 의한 환경오염문제를 야기하고 있으며 경제적인 측면에서도 고온조작등으로 인한 손실이 있다[4-5].

본 연구에서는 초임계 이산화탄소를 이용하여 starch를 폭쇄 전처리 한 후에 직접 enzyme(CGTase)을 반응시켜서 cyclodextrin을 생성하여 starch의 폭쇄에 의한 영향을 살펴보았다. 그리고 starch를 초임계 이산화탄소내에서 enzyme(CGTase) 의 최적조건에서 직접 반응을 시켜 상압에서의 cyclodextrin 생성량과 비교하였으며, product inhibition mechanism을 규명하였다.

실 험

1. 시약 및 장치

전분은 Sigma사(U.S.A)의 99% 순도를 가진 Potato starch를 사용하였으며, 전분의 cyclodextrin 합성 반응을 위한 효소(CGTase)는 3.0KNU/ML의 활성도를 가진 THORUZYME(Batch no.:ACN 00019)을 사용하였다. 그리고 product inhibition 실험을 위한 inhibitor는 SIGMA사(USA)의 □-Cyclodextrin을 사용하였다. 실험 장치는 Figure 1에 나타낸 바와 같이 이산화탄소 주입부, 교반 반응기 및 시료 채취부로 구성되어 있다. 온도 조절기가 달린 교반 항온 수조를 이용하여 반응기의 온도를 조절하였으며, 반응기 내부에 삽입된 thermocouple로 온도를 측정, ±0.5℃ 이내의 오차범위에서 온도를 일정하게 유지시켜 주었다.

12

PG

7   TG

3	8	11

2	4

TG

8

5

6	9

1

10

9

Fig. 1 Schematic diagram of experimental apparatus.

1. CO2 bomb	7. Pressure indicator

2. Liquid pump	8. Thermocouple

3. CO2 input line	9. Temperature indicator

4. Back pressure regulator	10. Digital stirring bath

5. Reactor	11. Sampling valve

6. Magnetic bar	12. Purge valve

2. 실험 방법

CGTase와 0.1M sodium acetate buffer solution(pH 6.0)을 혼합한 enzyme solution(2mL/L)에 starch를 100g/L가 되게 한 후에 enzyme(CGTase)의 최적온도인 60℃에서 항온교반수조를 이용하여 enzyme에 의한 starch의 cyclodextrin 생성반응을 수행하였고, 10분마다 시료를 채취하여 최적반응시간을 결정하였다.

CGTase enzyme solution(2mL/L, pH 6.0)에 starch를 50g/L가 되도록 첨가하고 반응기를 조립하고 초임계 상은 고압펌프를 이용하여 고순도의 이산화탄소(99.99%)를 주입한 후, 압축된 이산화탄소의 압력을 원하는 압력으로 ±1% 범위로 조절하였다. 온도는 thermocouple이 달린 교반항온수조에 반응기를 넣어 ±0.5℃ 이내의 범위에서 일정하게 유지시켜 주었다.

초임계 이산화탄소내에서의 enzyme kinetics 실험은 CGTase enzyme solution (2mL/L, pH 6.0)에 starch를 10, 12, 15, 30, 50, 100 g/L가 되도록 첨가하고 반응기를 조립하였다. 그리고, product inhibition을 알아보기 위하여 □-cyclodextrin 3, 5, 7, 10 g/L를 각각의 기질농도에 첨가하여 실험을 수행하였다. 반응기의 온도와 압력이 최적 반응압력과 온도에 평형이 된 후 20분 후에 시료를 채취하여 boiling water에 3분간 처리하여 enzyme을 불활성화시켰다[6].

결과 및 토론

Figure 2는 시간에 따른 cyclodextrin의 생성곡선에서 반응시간이 20분까지 거의 linear 하였으므로 초기반응속도를 결정하기 위한 반응시간을 20분으로 하였다. Figure 3은 초임계 이산화탄소내에서 enzyme 반응의 최적압력(160atm), 최적온도(60℃)에서 starch를 enzyme(CGTase) 반응을 시켜 얻은 cyclodextrin의 생성량을 상압에서의 생성량과 비교하였다. 초임계 유체하에서 24시간 enzyme 반응후에 37.33g/L의 cyclodextrin이 생성되었으며 상압에 비하여 1.4배 증가하였다. Figure 4와 Figure 5는 각각 상압과 초임계 이산화탄소내에서 starch를 기질로하여 enzyme(CGTase) 반응을 시키면서 반응 초기에 □-cyclodextrin을 각 농도로 첨가하여 반응시킨 군과 첨가하지 않고 반응시킨 것(control)의 초기반응속도를 측정하여 Lineweaver-Burk plot한 결과이다[7]. □-Cyclodextrindms enzyme(CGTase) 에 대하여 competitive inhibition으로 enzyme의 활성을 저해함을 알 수 있었다. 초임계 이산화탄소내에서 CGTase의 kinetic constants는 Km이 67.3 g/L-starch, Vmax는 1.4 g/L-cylodextrin 그리고 Ki는 5.7 g/L □-cyclodextrin 이었다.

참고 문헌

1. Cramer, F. (1987) Cyclodextrins and their industrial uses ; Duchene, D., Ed. P. 11, Editions de Sante, Paris.

2. French, D. (1957) The Schardinger dextrins. Adv. Carbohydr. Chem. 12:189-260

3. Szejtli, J.(1982) Cyclodextrins and their inclusion complexes. Akademiai  Kiado, Budapest.

4. Lee, Y.H., S.G. Baek, H.Y. Shin, and D.C. Park(1993), Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechol. 21,(5) 447-461.

5. Nakamura, K.(1990), Biochemical reactions in supercritical fluids, Tibtech, 8, 288-292.

6. Ahn, Joong-Hoon, Jin-Bong Hwang and Seung-Ho Kim(1990) Cyclodextrin Glucanotransferase from Bacillus stearothermophilus:Purification by Affinity Chromatography and Its Properties. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotech. vol. 18. No. 6. 585-590.

7. Han, Il-Keun, Yong-Hyun Lee, Production of Cyclodextrin from Raw Starch in the Agitated Bead Reaction System and its Reaction Mechanism, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 19(2), 163-170, 1991.

Figure 2. Enzymatic synthesis of  cyclodextrins    Figure 3. Enzymatic synthesis of cyclodextrins

in atmospheric condition.	supercritical carbon dioxide

( 160 atm, 60℃ ).

Figure 4. Lineweaver-Burk plot of the initial	Figure 5. Lineweaver-Burk plot of the initial

rate subjected to product inhibition	rate subjected to product inhibition

by □-cyclodextrin at atmosphere	by □-cyclodextrin in supercritical

reaction system.	carbon dioxide reaction system.