글루코스 농도 제어를 이용한 S. marcescens의 반회분식 고밀도 세포 배양에 의한 Chitinase 생성

손정우, 정호섭, 이천우, 이현주, 김광

동아대학교 화학공학과

Production of Chitinase by High Cell Density Fed-Batch Culture of Serratia marcescens with Glucose Concentration Control

Jeong-Woo Shon, Ho-Sup Jung, Cheon-Woo Lee, Hyun-Jo Lee, Kwang-Kim

Dong-A University, Department of Chemical Engineering

서론

반회분식 배양(fed-batch culture)은 미생물 배양의 한 방법으로서 배양기간동안 영양분의 농도가 적합한 수준으로 유지되는 것이 가능하며, 이러한 배양방법은 글루코스농도에 영향을 받거나 성장인자에 제한을 받는 미생물의 배양뿐만 아니라 짧은 배양시간 내에 고밀도의 균체량을 얻는데에도 유용하다. 발효기내로 영양분을 투입하기 위한 공급 시스템으로서 일정비율공급공정[1∼4], 지수적 공급공정[5,6] 그리고 조절 제어 지시 변수로서 대사작용에 의한 호흡속도 또는  pH를 이용하는 공정이 개발되고 있는 실정이다. 일반적으로 미생물의 성장을 제한하는 영양분은 아미노산, 비타민, 인산염, 황산염, 질소원, 미량의 금속이온 그리고 탄소원이 있다. 반회분식 반응에서는 미생물의 농도가 일반적으로 10g dry cells/L 이상이 되므로 대사에 필요한 산소는 성장 제한 인자가 되는 경향이 있다[7]. 따라서 배양액의 용존 산소 농도를 일정하게 유지시켜 주는 장치인 DO-stat가 배양의 안정된 조작을 위해 필요하며, DO-stat를 부착하게 되면 공기와 혼합된 순산소 또는 순수 산소를 독성 없이 발효기 내로 투입할 수 있고 높은 균체량(80∼120g/L)을 얻는 것도 가능하다. DO는 또한 탄소원이 성장 제한 인자가 될 때 탄소원을 공급하기 위한 조절 지시기로서 사용된다. 산업적 발효에서 균체량과 내부 세포효소 등의 생산성을 증가시키는 것은 가장 중요한 목표이며 feedback 변수로서 DO, pH 및 탄소원을 측정하여 양분 공급을 조절하는 반회분식 배양이 일반적으로 사용된다.

본 연구에서 Serratia marcescens는 기본 배지속에 성장을 제한하는 요소가 없는 조건하에서 각 시간에 따른 배양액 속의 글루코스 농도를 측정하고 DO의 변화 값과 비교하여 최적의 글루코스 투입시기를 결정하였다. 이것을 바탕으로 최대의 Chitinase를 생성시키기 위한 S. marcescens의 최대 균체량을 얻을 수 있는 조건을 결정할 수 있다.

실험

1. 균주 및 배지

본 실험에서 사용한 균주는 Serratia marcescens QM B1466(ATCC 990)로서chitinase를 생성하는데 가장 적합한 균주로 알려져 있다[8]. 균주의 활성을 유지하기 위하여 고체배지에 계대배양하였고, 이때 고체배지는 DIFCO사의 nutrient agar를 사용하였다. 세포밀도를 일정하게 유지하기 위해 250mL 삼각플라스크에 한 colony를 액체배지에 접종하고  17시간 동안 250rpm으로 진탕 배양기에서 배양하였으며, 이 배양액 30mL를 반회분식 발효기 내의 발효배지 3L에 접종하였다. 각각의 배지 조성은 Table. 1에 나타내었다. 배지 중에 포함된 미량의 금속 원소는 1%(v/v)로 배지에 첨가하였고, 실험에 사용된 배지 및 첨가물들은 모두 121.3℃, 15 gauge압력에서 20분간 고압멸균기로 멸균한 뒤 사용하였다.

Table. 1 Media for Fed-Batch Fermentation of Serratia marcescens QM B1466

Component	Stock(%)	Base Fermentation media(g/L)	Feed strategy (g/L)
Dextrose(glucose)	2	2	500
Pepton	2
Yeast extract	1
KH2PO4		6.80
K2HPO4		2.61
NaCl		10.00
(NH4)2SO4		1.00
MgSO4(7H2O)		0.123
CaCl2		0.0147
Trace Metal*		1.0%(v/v)
pH control			1N NaOH

*(in 1 L distilled water): 3.84g citric acid, 55.6mg FeSO4(7H2O), 28.7mg ZnSO4(7H2O), 16.9mg MnSO4(H2O), 2.5mg CuSO4(5H2O), 2.5mg CoCl2, 6.2mg H3BO3

2. 배양장치 및 방법

실험에 사용된 발효기는 일본 Marubishi사의 5L 용량의 jar type 반응기로 pH제어기와 온도제어기, 교반속도제어기 공기공급 유량기 및 용존산소 측정기가 장치되어 있다. 초기 발효배지의 부피는 3L로 하였으며 배양온도는 30℃를 유지하였고 pH는 1N NaOH를 연동펌프로 투입하여 7.0±0.2로 조절하였다. 산소의 공급은 유량과 교반속도를 0.5∼0.9L/min 와 200∼500rpm 으로 조절하여 용존산소 수준을 30%로 유지하였다. 소포제는 Sigma 사의 antifoam C를 10%로 희석하여 투입하였다. 반응기 내의 글루코스 농도는 글루코스 용액(500g/L)을 사용하여 2g/L가 되도록 조절하여 투입하였다.

3. 분석방법

건조균체의 질량은 시료를 채취하여 8,000rpm 에서 15분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 증류수로 세척한 뒤 80℃에서 30분간 건조시켜 수분을 완전히 빼낸 후 무게를 측정하였다. 배양액 중의 글루코스 농도는 위에서 원심 분리한 상층액을 사용하여 DNS법으로 540nm에서 측정하였다.

결과 및 고찰

고밀도의 미생물 생장을 위한 영양분에서 가장 요구되는 것은 유기산 생성의 최소화와 공급계획의 치밀함이다. 용존 산소는 글루코스 공급과 비증식속도를 조절하고, acetate생성물을 최소화하며 발효기 내의 글루코스 농도의 조절을 가능하게 한다. 세포 산소 흡수 속도(Oxygen Uptake Rate: OUR)는 양분의 상태에 따라 변화한다. 양분고갈상태에서 세포 호흡 속도는 급격히 감소한다. 탄소원이 하나인 최소배지에서는 글루코스가 소모되면 OUR이 급격히 감소하고 DO 농도는 증가한다[9].

Fig. 1은 배양액의 글루코스 농도와 균체량의 변화를 나타낸 것이며, 24시간에서 최대 균체량 89.334g/L를 얻을 수 있었다. 배양 3시간 이후부터 균체량은 지수적으로 증가함을 알 수 있다. 균체량 증가 곡선에서 글루코스 용액을 투입하기 직전에 성장속도가 약간 둔화됨을 관찰할 수 있는데 이는 글루코스 농도를 측정하는 과정에서 시간이 약간 소요되었고 이로 인해 글루코스의 부족으로 인한 성장 저해 요인이 발생되었던 것으로 생각된다. Fig. 2는 배양기간 동안의 pH와 DO변화를 나타낸 것이다. DO는 미생물이 증식함에 따라 급격히 감소하였고 글루코스가 고갈된 기간인 9시간, 13시간 때에 급격히 증가하는 경향을 나타내고 있으므로 글루코스 투입시기를 예측할 수 있는 변수가 되고 있음을 보여주고 있다.

차후의 실험은 초기 글루코스 농도의 변화 및 다른 영양분의 조절에 따른 최종 건조 균체 질량의 변화와 고밀도의 균체량을 얻을 수 있는 최적 조건을 연구하고 이를 바탕으로 최대의 chitinase를 생성 할 수 있는 조건을 구하고자 한다.

참고문헌

1. Hosler, p and M. J. Johnson: Ind Eng. Chem., 45, 874 (1953).

2. Pirt, S. J.: Appl. Chem. Biotechnol., 24, 415 (1974).

3. Yamane, K., H. Suzuki and K. Nishizawa: J. Biochem., 67, 9 (1970).

4. Yoshida, F., T. yamane and K. Nakamoto: Biotechnol. Bioeng., 15, 257 (1973).

5. Lim, H. C., B. J. Chen and C. C. Cregen: Biotechnol. Bioeng., 19, 425 (1977).

6. Yamane, T., M. Kishimoto and F. Yoshida: J. Ferment. Technol., 54, 229 (1976).

7. Hironori Mori, Takuo Yano, Takeshi Kobayashi and Shoichi Shimizu:          Journal of Chemical Engineering of Japan, 12, 313 (1979).

8. Monreal and E. T. Reese: Canadian Journal of Microbiology, 15, 689-696     (1969).

9. Diane Hasenwinkle, Eric Jervis, Oliver Kops, Chang Liu, Gary Lesnicki,       Charles A. Haynes, Douglas G. Kilburn: Biotech. Bioeng., 55, 854(1996).