콜라젠 젤 내에서의 쥐 일차 간세포 및 간세포 구상체 배양

이 두훈, 양 성문, 박 정극

동국대학교 공과대학 화학공학과,

Culture of Rat Primary Hepatocytes and Hepatocyte Spheroids

in Collagen Gel

Doo-Hoon Lee, Sung-Mun Yang, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering, Dongguk University

서  론

최근의 의학 발달에도 불구하고 전격성 간손상(fulminant hepatic failure, FHF) 환자의 경우는 치사율이 90%에 이르고 있다. 이러한 경우의 생존율을 높이기 위하여 최근에는 간조직이나 간세포를 이용하여 체외 순환형의 간 보조장치를 개발하는 연구가 활기를 띠고 있다(1). 이러한 생물학적 인공간(Bioartificial Liver)을 개발하기 위해서는 간세포의 간 특이 기능 활성이 우수한 상태로 장기간 배양하는 기술이 필수적으로 선행되어야 하지만 단층배양과 같은 일반적인 배양조건에서 간세포는 매우 짧은 시간 내에 간기능을 상실하며 빠른 속도로 괴사한다. 이러한 체외 배양 특성을 갖는 간세포를 체외에서 장기배양하려는 노력은 주로 배양 배지의 성분 조절과 세포외 기질의 연구에 집중되었다. 즉, 각종 호르몬, 성장인자, 영양분, 미량 성분 등의 영향이 많이 연구되어왔으며(2) collagen type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ, fibronectin, laminin 등의 세포외 기질을 배양 표면에 coating 하거나 gel 내에서 배양하는 등의 방법으로 간세포의 간기능 활성과 생존도를 많이 증대하였다(3). 또한 간세포를 구상체(Spheroid) 형태로 배양하여 단층의 형태로 배양하는 것 보다 간세포 기능을 높은 수준으로 장기간 유지시키기도 하였다(4).

본 연구에서는 간세포와 간세포 구상체를 콜라젠 젤에 embedding하여 세포-기질, 세포-세포 간의 상호작용이 간세포의 간기능 유지에 미치는 영향을 관찰하였다.

실험 재료 및 방법

쥐 간세포의 분리

간세포의 분리는 Seglen-method(5)에 기초 둔 개선된 방법을 사용하였는데 이 방법은 in situ 상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 기술로서 그 순서는 다음과 같다. 180-200g 정도의 무게를 갖는 SD-rat을 케타민(0.1 ml/rat 100g, 유한양행)과 럼푼(0.01ml/rat 100g, 바이엘코리아(주))을 주사하여 마취시키고, 해부용 가위를 사용하여 쥐의 복부를 열어 간문맥(potal vein)을 찾아서 catheter를 삽입하고 결찰사로 고정시킨 후 1단계로, calcium-free HEPES 버퍼를 25 ml/min의 유속으로 10-15분 흐르게 하여 간을 충분히 세척한다. 2단계로는 0.05% 농도의 콜라젠 분해 효소를 넣은 동일 완충용액을 20 ml/min의 유속으로 10분 동안 흐르게 하여 간조직의 기질부분을 분해한다. 효소 처리가 끝난 간을 잘라내어 페트리디쉬에 옮긴 후 수술용 메스로 캡슐을 자르고 거즈와 나일론 매쉬에 거른 후 4회의 원심분리(500rpm, 2분)로 간세포 만을 분리한다. 분리된 간세포를 Trypan blue dye exclusion 방법과 hemacytometer를 사용하여 세포 농도와 생존도를 측정하였다. 보통 2∼3×108개 정도의 세포가 얻어지며 80% 이상의 생존도를 갖는다.

간세포 단층 및 구상체 배양

배양 배지로는 William's E Medium에 Epidermal growth factor(20□g/l), Insulin(10mg/l), CuSO4·5H2O(0.1□M), ZnSO4·7H2O(50pM), H2SeO3(3□g/l), Linoleic acid(50mg/l), NaHCO3(1.05g/l), HEPES(1.19g/l), Penicillin(0.0588g/l), Streptomycin (0.100g/l)을 첨가하여 사용하였다. 단층배양에 사용하는 직경 35mm 배양 well (Nunc Co. 6 well plate)은 0.5 mg/ml 농도의 collagen(Type 1, Cellmatrix, Nitta gelatin, Japan) 용액으로 바닥을 두 번 적신 후 건조시키고 UV에 16시간 노출시킨 후 간세포 접종 직전 배양 배지로 한번 세척한 후 사용하였다. 간세포 구상체 형성을 위해서는 자석 교반봉이 달려있는 spinner vessel(250ml, vertical paddle, Bellco Co.)을 사용하여 부유배양을 실시하였으며 배양 부피는 100 mL 로 하였다. 세포 접종이 끝나면 37℃, 5% CO2 / 95% air CO2 incubator내에 설치한 multi stirrer(Bellco Co.)위에서 60 rpm의 속도로 교반을 시키며 배양하였다. 단층 배양과 구상체 배양 모두 5×105 viable cells/mL의 접종 농도를 사용하였고 구상체는 부유배양 시작 후 약 2일이 경과하면 직경 170∼240□의 간세포 구상체가 형성된다. 사용된 배지는 암모니아, 요소, 알부민 분석을 위하여 -20℃에서 보관하였다.

콜라젠 젤 내에서의 간세포 및 간세포 구상체 배양

3mg/mL 콜라젠(Type 1, Cellmatrix, Nittagelatin, Japan) 용액, 10배 농축배지, 완충용액을 8:1:1로 혼합하여 중성 pH를 가지는 콜라젠 용액을 제조하였다. 간세포의 경우는 5×10`cells /ml 의 세포농도로 분산시킨 후 배양 well(Nunc Co. 12 well plate)에 1ml 씩 분주하였으며 간세포 구상체의 경우는 부유배양 액을 동일 부피만큼 취하여 단일세포와 비슷한 농도가 되도록 하였다. 간세포나 간세포 구상체가 포함된 콜라젠 용액을 well에 분주한 후 37℃ CO2 incubator에 20분간 정치하면 젤화되며 이때 배지를 첨가하였다.

간기능 활성도 측정

배양된 간세포 구상체의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고 이에 따른 urea 생성농도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거 속도를 측정하기 위하여 배양 4일째 부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 법을 사용하였는데, 1차항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION 시약을 사용하였으며, 1차항체는 2□/□를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

결과 및 토론

콜라젠 젤 내에서의 간세포 및 간세포 구상체 배양

Fig. 1의 A, B는 콜라젠 젤 내에 배양된 간세포와 간세포 구상체이다. 콜라젠 젤 내에 배양된 간세포는 콜라젠의 종류나 배지 성분에 따라 그 형태가 다르다고 알려져 있다(6). 본 실험 조건에서 간세포와 간세포 구상체는 천천히 spreading되는 경향을 보였다. 그러나 그 정도나 속도는 실험 마다 조금씩 다르게 나타났다.

간기능 활성도 측정

암모니아 제거 및 요소 분비 속도는 단층배양의 경우와 콜라젠 젤 내에 배양된 간세포와 간세포 구상체가 비슷하게 나타났다. 그러나 Fig. 2에 나타난 것 처럼 알부민 분비 속도는 콜라젠 젤 내에 배양된 간세포와 간세포 구상체의 겨우가 훨씬 오래 높은 수준이 유지되었다. 또한 단일 간세포 보다는 간세포 구상체를 젤 내에 배양한 경우에 알부민 분비 속도가 더욱 오래 유지되었다. 즉, 세포-기질의 상호 작용과 세포-세포 상호 작용은 간기능의 유지에 매우 중요한 요인인 것으로 판단된다.

콜라젠 젤은 간세포 및 간세포 구상체를 장기간 배양하기 적당한 세포외 기질로 판단되며 체외 인공간 보조장치의 개발에 유용한 수단을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 단층 젤의 형태로는 scale-up을 하기 어렵기 때문에 이에 대한 연구가 계속되어야 할 것이며 또한, 콜라젠 젤 내에서의 간세포 형태 결정에 미치는 영향과 간세포의 형태가 간기능에 미치는 영향에 대하여도 계속 연구하여야 할 것이다.

Fig. 1 Light microscopic  pictures of rat hepatocytes and hepatocyte spheroids in collagen gel. A: Dispersed hepatocytes, 5days, 100×, B:Spheroids, 5days, 100×.

Fig. 2 Albumin secretion rates of hepatocytes cultured as monolayer and hepatocytes and hepatocyte spheroids cultured in collagen gel.

참고문헌

1. Jacek Rozga, Achilles A. Demetriou, et.al.,Isolated Hepatocytes in a

Bioartificial Liver: A Single Group View and Experience,

Biotechnology and Bioengineering, Vol. 43, 645-653, 1994.

2. Enat, R., D. M. Jrfferson, N. Ruiz-Opazo, Z. Gatmaitan, L. A. Leinwand,

and L. M. Reid, Hepatocyte Proliferation in vitro: Its Dependence on the

Use of Serum-free Hormonally Defined Medium and Substrata of

Extracellular Matrix, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1411-1415, 1984.

3. Dunn, J. C., Y. Martin, and L. Yarmush, Long-Term In Vitro Function of

Adult Hepatocytes in a Collagen Sandwich Configuration, Biotechnol. Prog.,

7, 237-245, 1991.

4. Li, A. P., S. M. Colburn, and D. J. Beck, A Simplified Method for the

Culturing of Primary Adult Rat and Human Hepatocytes as Multicellular

Spheroids, In Vitro Cell. Dev. Biol., 28A, 673-677, 1992.

5. Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell.

Biol., Vol. 13, 29-83, 1975

6. Nishikawa, Y., Y. Tokusashi, T. Kadohama, H. Nishimori, and K. Ogawa,

Hepatocytic Cells Form Bile Duct-like Structures within a

Three-Dimensional Collagen Gel Matrix, Experimtal Cell Research, 223,

357-371, 1996.