Pseudomonas sp. JU-1의 분리 및 Benzene과 Toluene의 분해

김진욱, 강동일, 진환준, 박기용, 고창웅*, 김남기

성균관대학교 화학공학과, 삼척대학교 화학공학과*

Isolation of Pseudomonas sp. JU-1 degrading Benzene and Toluene.

JinUook Kim, DongIl Kang, HwanJun Jin, KiYong Park, ChangUng Ko*, NamKi Kim

Department of  Chemical Engineering, SungKyunKwan University.

Department of  Chemical Engineering, SamChuck University.*

서론

방향족 화합물은 화학공업에서 다량으로 사용되고 방출된다. 방향족 화합물들은 벤젠고리를 가지는 구조적 특징으로 인하여 대부분의 화합물들은 생체에 독성을 나타낼 뿐만 아니라 자연 분해가 어렵다는 단점으로 인해 환경오염의 주요 원인으로 대두되고 있다.

방향족 화합물을 분해할수 있다고 보고된 미생물로는 Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas sp., Achromobacter sp., Nocardia sp., 그리고 Acinetobacter sp.등이 있다.

대표적인 방향족 화합물 중 Benzene과 Toluene에 대한 분해능을 가지는 균주를 방향족 화합물에 오염된 토양에서 분리 동정하여 고농도(1250ppm)에서의 Benzene과 Toluene을 분해함으로써 Bioremediation공정에서 난분해성 방향족 화합물질을 처리하는 기초 자료를 얻고자 한다.

실험

배지 및 시약

최소배지

증류수 1□중

NH4Cl 1g, K2HPO4 4.35g, NaH2PO4 3.9g, MgSO4·7H2O 0.38g, CaCl2 0.03g,     H3BO3 2.86g, MnCl2·4H2O 1.81g, ZnSO4 0.222g, Na2MoO4·2H2O 0.39g,        CuSO4·5H2O 0.079g, Co(NO3)2·6H2O 49.4□

pH는 7.0

유일한 탄소원으로 Benzene과 Toluene 사용.

균주의 분리 및 보관을 위한 완전배지

Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 8g, 증류수 1□

평판 고체배지는 상기 배지에 agar를 1.5%(w/v)농도로 첨가하여 사용.

균주분리 및 선별

서울 근교의 토양의 균원시료를 멸균수로 희석한 후 희석액을 유일 탄소원으로 방향족화합물을 함유한 액체 최소배지에 접종, 배양하였다. 이 배양액을 분리원으로 하여 3회에 걸쳐 24시간 간격으로 enrichment culture를 수행한 후 배양액을 희석하여 고체배지에 도말하였고, colony를 순수분리하였다. 순수분리된 균주를 액체 최소배지에 Benzene과 Toluene을 1250ppm 농도로 첨가한 후, 250ml flask에서 배양하여 균체증식과 분해능이 높은 균주를 최종 선발하였다. 이때 Benzene과 Toluene의 휘발을 방지하기 위하여 silicone rubber로 flask 입구를 막았다.

균주의 배양

분리균주를 Benzene과 Toluene이 각각 첨가된 최소배지에서 2회에 각24시간씩 배양하여 활성화 시킨 후 종균으로 사용하였으며, Benzene과 Toluene 1250ppm이 첨가된 최소배지 50□에 전배양액을 10%(v/v)가 되게 접종하고, 초기 O.D.를 0.07로 일정하게 유지하여 접종하였으며, 30℃, 150rpm으로 진탕배양하면서 배양시간에 따른 균체증식, pH 변화, 기질의 농도를 조사하였다. 균체증식은 배양액을 취하여 UV spectrophotometer를 사용하여 640nm에서 배양액의 흡광도로 나타내었다.

균주의 동정

분리균주의 동정은 형태적, 생리적 및 생화학적 특성을 조사한 후 Bergey's manual of determinative bacteriology(8th ed.)와 Manual for the identification of medical bacteria(2nd ed.)에 따라서 실시하였다.

결과 및 토론

Benzene과 Toluene 분해균주의 분리

총 39개의 토양 시료중에서 Benzene과 Toluene을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용하는 균주를 분리하여 생육이 우수한 균주를 분리하였다. 특히 분리균주 Pseudomonas sp. JU-1은 최소배지에서 48시간 배양시, 36시간이 지난후 O.D.값이 Benzene인 경우 0.825와 Toluene인 경우 0.876로 분리균주 중에서 생육이 가장 좋고 Benzene과 Toluene 분해능이 우수하여 최종균주로 선정하였다.

균주의 동정

분리균주 Pseudomonas sp. JU-1은 형태적, 생리화학적 특성을 조사한 결과는 Table. 1에 나타내었다. 본 균주는 호기성 세균으로서 운동성이 있는 Gram 음성균으로 Oxidase와 Catalase는 양성, Glucose 이용시 산을 형성하지 않았으며, Carbohydrate의 O/F반응은 둘다 양성 반응을 보이는 특징을 나타내었다. 이러한 결과로 이 균체는 Pseudomonas sp.와 거 비슷한 것으로 나타났으며, 따라서 상기 형태적, 생화학적 특성에 의한 균주 동정결과, Pseudomonas sp. JU-1이라고 명명하였다.

Table. 1. Morphological and biochemical characteristics of the isolated strain JU-1

Characteristics	JU-1	Characteristics	JU-1

Shape	rod	PNPG(p-nitro-phenyl-□D-galactopyranoside	-
Gram stain	-	Glucose	+
Motility	+	Arabinose	-
Oxidase	-	Monnose	+
O/F test	Oxidation	Mannitol	-
Denitrification	-	N-acetyl-glucosamine	-
Nitrate used as a nitrogen source	+	Maltose	-
Indole production	-	Gluconate	+
Glucose acidification	-	Caprate	+
Arginin dehydrolase	+	Adipate	-
Urease	-	Malate	+
Esculin hydrolysis	-	Citrate	+
Gelatine hydrolysis	-	Phenyl-acetate	+

분리균주의 생육 곡선

Benzene과 Toluene을 유일 탄소원으로 첨가한 최소배지에서 배양시간에 따른 분리균주의 균생육 및 기질의 농도변화를 Fig. 1과 Fig. 2에 나타내었다.

Pseudomonas sp. JU-1은 유도기가 거의 없이 급격한 균체증식을 나타내었으며, 배양 후 36시간에서는 O.D.가 Benzene인 경우 0.825와 Toluene인 경우 0.876로 최대의 균체량을 나타내며 정지기에 도달하면서 pH는 Benzene인 경우 6.64와 Toluene인 경우 6.65로 감소하였다. Pseudomonas sp. JU-1의 생육 최적온도를 알아보기 위하여 최소배지에 각 Benzene과 Toluene을 500ppm, 1000ppm, 1250ppm, 1500ppm을 넣고 48시간 배양한 결과 Fig. 3과 Fig. 4와 같은 결과를 얻었다. 이와 같은 실험을 pH와 rpm과 온도에 대해 실험한 결과. pH 7.0, rpm은  150 이었고, 최적 온도는 30℃였다.

참고문헌

1. Zeyer, J., Kuhn, E. P. and Schwarzenbach, R. P.,: Appl. Environ. Microbiol.,     52, 944-947(1986)

2. 김성빈, 1996. Candida tropicalis PW-51을 이용한 페놀분해와 페놀수지 폐수    의 처리. 충북대 석사학위논문.

3. 이승우, 이준명, 장덕진, 1998. Pseudomonas F1과 Burkholderia cepacia G4에     의한 BTEX, trichloroethylene의 분해. 한국생물공학회지. 13. 561∼568.

4. 이창호, 오희목, 권태종, 안성구, 권기석, 고영희, 윤병대, 1994. Toluene을 분해    하는 Acinetobacter sp. GEM63의 분리 및 특성. KOR. JOUR. MICROBIOL.    32. 329∼335.

5. 염승호, 1998. Hyrid 생물반응기를 이용한 BTX 분해. 서울대학교 공학박사학위 논문.

Fig. 1. Time courses of cell growth and pH by Pseudomonas sp. JU-1 in a minimal medium containning benzene as a sole source.	Fig. 2. Time courses of cell growth and pH by Pseudomonas sp. JU-1 in a minimal medium containning toluene as a sole source.

Fig. 3. Effect of concentrations on the growth of Pseudomonas sp. JU-1 (Benzene)	Fig. 4. Effect of concentrations on the growth of Pseudomonas sp. JU-1 (Toluene)