재조합 Bacillus subtilis 유가식배양을 이용한 Bacillus macerans 유래의 Cyclodextrin Glucanotransferase의 대량 생산

라찬수*, 송재욱, 김창섭, 한남수, 서진호

서울대학교 식품공학과, *서울대학교 생물화학공학협동과정, 농업생물신소재연구센터

Production of Cyclodextrin Glucanotransferase of Bacillus marcerans in Fed-Batch Fermentation of Recombinant Bacillus subtilis

Chan-Su Rha*, Jae-Wook Song, Chang-Sup Kim, Nam Soo Han and Jin-Ho Seo.

Department of Food Science and Technology, *Interdisciplinary Programs for Biochemical Engineering and Biotechnology, Research Center for New Bio-Materials in Agriculture, Seoul National University, Suwon 441-744, Korea

서론

Bacillus subtilis 는 유전 정보가 많이 알려져 있고 성장속도가 빠르며 목적 단백질을 세포 밖으로 분비하는 특성으로 인해 생산된 효소의 분리 및 정제에 소요되는 비용이 절감되어 다양한 효소 생산에 이용되고 있다. Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)는 전분을 기질로 하여 포도당분자 6, 7 또는 8개가 1,4-glucosidic bond로 연결된 환형 구조의 □,□,□-cyclodextrin(CD)을 생성한다. B. macerans 유래의 CGTase는 □-CD를 주로 생성하며, 산업적으로 이용가치가 높아 의약품, 식품보조제, 살충제 등으로 사용된다. 본 연구에서는  CGTase발현 효율을 증대하기 위하여 재조합 B. subtilis 유가식 배양의 발효전략을 최적화였다.

재료 및 방법

Microorganism

B. subtilis LKS88로서 B. macerans의 CGTase유전자를 가진 plasmid(pUBACGT)로 형질전환 된 것이다.

Fermentation

2.5L jar fermentor(한국발효기)에서 working volume 1L, 37 ℃, pH 7.0에서 DO가 30%를 유지하로록  agitation 속도를 조절하며 수행하였다(PID control). 배지는 Luria Bertany 와 FBd(defined medium)를 사용하였다. 초기 탄소원을 포도당만 적용한 것과 포도당과 수용성 전분을 섞어 적용한 것으로 구분된다.

Feeding Strategies

발효초기에 DO수준이 상승하기 시작할 때 나머지 탄소원을 전부 소모된 상태가 아니므로 기질수준제한으로 유가식배양을 수행하기 위해서 yeast extract 10g 과 peptone 14g을 농축하여 4시간마다 1번씩 3번적용하였다.  당주입은 세포성장속도 및 기질 소모속도를 측정하여 포도당 500g/L 와 포도당 300g/L+수용성전분 200g/L를 공급하는 주입전략을 사용하였다.  고농도발효를 유도하기 위해 DO를 표지로 하여 상승하는 시점에 질소원을 주입하고 포도당 소모시점을 파악하여 식(1)의 계산을 통하여 탄소원을 주입했다.

[eqn: F={muXV} over{(S_0 -S) Y_x/s} ~~--- ⑴]

Glucose Analysis

Glucose analyzer (YSI 1500G, USA), 영동제약의 Glucose-E kit 으로 정량하였다.

CDs and Maltooligosaccharides Analysis

Thin-Layer chromatography를 사용하여 배양액중의 CDs와 maltooligosaccharide를 분석하였다. 용매는 nitromethane : water : 1-propanol = 2 : 1.5 : 3 (v/v) 이며 2번 전개하였다. Densitometer로 농도 분석을 하였다.(그림5)

CGTase Activity

효소역가는 M□kel□ at el 이 사용하였던 방법을 수정하여 사용하였다. CGTase에 의해 생성된 □-CD는 반응액중에 있는 메틸오렌지를 포집하게되어 흡광도가 감소하므로 적당하게 희석된 효소액은 25 ℃에서 단위시간당(1 min) 생성되는 □-CD로 역가를 나타내게 된다.

결과 및 토론

대수성장기중의 세포성장이 LB보다 FBd배지에서 빠르게 나타났다. CGTase생산은 non-growth associated production의 형태로 나타나 발효 후반부에 효소 생산이 이루어졌다.   수용성전분을 feeding solution에 혼합한 경우가 두 종류의 배지에서 효소 발현이 높았는데 이는 전분이 CGTase발현량을 높이는데 효과가 있는 것으로 보인다. 전분으로 인한 발현량 증가는 정지기가 시작되는 25시간부터 두드러지는데 이로인해 중간산물인 CDs는 감소하게되고 올리고당의 증가가 나타나(Fig 3) 발현량을 간접적으로 알 수 있으며 올리고당이 CGTase 발현증가에 효과가 있는 것으로 추정된다. 가장 좋은 CGTase 발현은 defined medium에서 14 U/ml 의 역가와 228U/L hr의 단위부피생산성으로 단순회분식배양에서보다 각각 4.8, 2.4배 증가되었다.

Figure  Fed-batch 1

LB medium, Glucose 500g/L feeding

Figure  Fed-batch 2

FBd medium, Glucose 300g/L+Soluble starch 200g/L feeding

●-DCW, ■-Glucose concentration in medium, ▲-CGTase activity, N-Nitrogen source feeding

Figure  배양액중의 CDs와 올리고당의 농도변화

참고문헌

Dae-Ok Kim, Kyungmoon Park,  Jae-Wook Song and Jin-Ho Seo, Enhanced Production of Matotetraose-producing Amylase by Recombinant Bacillus subtilis LKS88 in Fed-batch Cultivation, Journal of Microbiology and Biotechnology. v7(6), 417-422, 1997

Dae-Ok Kim, Kyungmoon Park, Young-Bae Kim and Jin-Ho Seo, A Parametric Study of Production of Maltotetraose-producing Amylase in Recombinant Bacillus subtilis LKS88,  Foods and Biotechnology, v5(4), 322-329, 1996

Kim, Chang-Sup, Jae-Wook Song, Chung-Im Kim, Hee-Hyun Jin and Jin-Ho Seo, Analysis and Expression of Bacillus macerans Cyclodextrin Glucanotransferase in Recombinant Bacillus subtilis,  Annals, Research Center for New Bio-Materials in Agriculture, v6, 60-78, 1997

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