곤충병원성 선충의 공생 박테리아인

Xenorhabdus nematophilus에 의해 생산된 세포외 살충 독성물질 정제

배준상, 류근갑

울산대학교 화학공학부

Purification of Extracellular Insecticidal Toxin

Produced by Xenorhabdus nematophilus, a Symbiotic Bacterium

of Entomopathogenic Nematodes

Jun-Sang Bae, Keun-Garp Ryu

School of Chemical Engineering, University of Ulsan

서론

많은 환경적, 생물학적인 우려를 일으키는 화학적 살충제의 사용을 대체할 수 있는 생물학적 살충제의 개발을 위해 Steinernema와 Heterohabditis 속의 곤충병원성 선충에 관심이 집중되고 있다 [1,2]. 선충은 장내에 공생 박테리아의 형태로 Xenorhabdus 또는 Phtorhabdus 종들을 지니고 다니면서 해충을 감염시킨 후 해충의 혈장 내로 박테리아를 분비한다 [3]. 박테리아는 24-48 시간 내에 해충을 사멸시키고 선충의 재생산을 위한 안정적인 조건을 제공한다. 박테리아는 primary (phase I)와 secondary (phase II) 두 가지 형태로 존재한다. Primary 형태는 infective 선충 단계에서 많이 존재하는 반면 secondary 형태는 primary 형태를 장기간 배양한 in vitro 배양 배지에서 형성되거나 [4,5] 또는 박테리아가 토양 속에 있을 때 형성된다 [6]. 단백질 분해 효소는 주요 독성 요인들 중의 하나로서 선충/박테리아 복합체의 병원성에 기여한다. Schimdt et al. [3]은 gelatin 배지에서 배양된 Xenorha- bdus luminescens의 primary 형태로부터 세포외 단백질 분해 효소를 정제하고 특성을 연구하였다. 최근에는 Bowen et al.가 Phtorhabdus luminescens 공생 박테리아의 배양 여액으로부터 단백질 분해 효소의 활성이 부족한 몇몇 종류의 독성물질을 정제한 것이 보고되었다 [7].

실험

배양 생물 및 조건

본 연구는 Park and Yu [8]에 의해 배양된 X. nematophilus XR-NC를 사용하였다. 고체 배양은 bromothymol blue의 흡수에 여부에 따라 공생 박테리아의 primary 와 secondary phase를 green과 dark red color로 구분할 수 있는 NBTA agar plate에서 25℃로 했다 [9]. NBTA 배지는 liter 당 20 g의 nutrient agar (Difco), 25 mg의 bromothymol blue (Sigma), 그리고 40 mg의 triphenyltetrazolium (Sigma)로 구성되어 있다. Seed 배양은 NBTA agar plate에서 배양된 green color인 primary 형태의 박테리아를 250 mL flask, 100 mL의 액체 배지에 선택적으로 접종하였다. Flask 배양은 28℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 교반 하였다. 본배양은 7 L jar fermenter, 4 L 액체 배지에서 실행되었고 seed 배양액을 접종한 후 28℃에서 공기 유속 0.8 L/min, 500 rpm으로 교반 하였다. 독성물질은 24시간 동안 배양된 본배양액으로부터 정제되었다. 액체 배지는 liter 당 50 g yeast extract (Merck), 5 g NaCl, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g NH4H2PO4, 그리고 0.2 g MgSO4·7H2O로 구성되었다.

정제

X. nematophilus의 배양액은 세포 제거를 위해 원심 분리하였다. 배양 여액은 분자량의 cut off가 10,000인 PM-10 membrane (Amicon)을 사용한 ultera- filtration을 이용하여 농축하였다. 그런 다음 DEAE Sephadex A-50 (Pharma- cia)가 packing된 anion-exchange column에 가했다. Column은 10 mM Tris- HCl과 여러 농도의 KCl을 포함한 buffer (pH 8.1)를 단계적으로 elution 시켰다. 독성물질이 포함된 fraction을 모아 ulterafiltration을 이용해 농축한 다음 gel filtration column (Progel-TSK G3000SWXL)이 사용된 HPLC에 가했다. HPLC column은 0.2 mL/min 속도로 buffer (0.3 M KCl, 0.05 M KH2PO4, pH 6.9)를 흘렸다. 다시 독성물질이 포함된 fraction을 모아서 Sephadex G-25 column (Sigma)을 이용하여 salt를 제거하였다. salt가 제거된 sample은 다음 분석을 위하여 동결 건조 하였다. 모든 정제 과정은 4℃에서 진행되었다.

전기영동

Reducing SDS-PAGE는 Laemmli [10]에 의한 방법에 따라 실행되었다. Slab gel은 stacking gel (3.8% acrylamide) 과 resolving gel (12.5% acryl- amide)로 구성된 것을 이용했다. 전기영동은 약 1시간 동안 전류 20 mA를 유지하면서 실행되었다. 전기영동이 끝난 후 gel은 0.025% Coomassie briliant blue R-250이 포함된 methanol-acetic acid-water (40:7:53 by volume)에서staining을 한 다음 methanol-acetic acid-water (7.5:5:87.5 by volume)에서 destaining 했다.

FTIR-spectroscopy

동결 건조된 정제 독성물질을 KBr과 균일하게 혼합했다. 혼합 분말을 pallet으로 만들어 FTIR-spectroscopy (ATI Mattson Genesis Series FTIR)로 분석했다. Data는 400에서 4,000 cm-1 까지의 wavenumber에서 측정되었다.

살충 독성 측정

살충 독성 측정은 Galleria mellonella 유충을 이용해 Park and Yu [9]의 방법에 의해서 실행되었다. 3□L 액체 sample을 유충의 혈장에 microsyringe를 사용해 주사했다. 각 sample에 대해 4 마리 또는 5 마리의 Galleria mell- onella 유충을 이용했고 이는 25℃에서 배양되었다. sample 주사 후 유충의 사멸 수는 경과된 시간에 따라 계산되었다.

결과 및 토의

농축된 배양 여액 20 mL을 buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.1)로 100 mL이 되게 희석한 다음 DEAE Sephadex A-50으로 packing된 anion-exchange chromatography column (2.6 x 30 cm)에 가하였다. Column은 buffer의 KCl 농도를 0, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 그리고 1.0 M로 증가시키며 단계별로 elution 시켰다 (first anion-exchange chromatography). 280 nm에서 각 fraction의 흡광도를 측정하였다. First anion-exchange chromatography에서는 0.3 M KCl buffer에 의해 elution 되어 농축된 sample이 가장 높은 독성을 가지는 것으로 나타났다. 한편 나머지 KCl 농도의 buffer에 의해 elution 된 sample들은 독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. anion-exchange column에서 toxin을 분리하기 위해 사용한 KCl의 농도 범위를 감소시키기 위해서 위에서 설명한 농축된 배양 여액을 loading한 DEAE A-50 column을 0.2 M KCl로 washing 하였다. 그리고 column을 0.22, 0.25, 0.27, 그리고 0.3 M KCl이 포함된 buffer를 단계별로 elution 시켰다 (second anion-exchange chromato- graphy). Fig. 1-A는 두 번째 anion-exchange chromatography elution 결과를 보여준다. Fig. 1-B에서는 0.25 M KCl buffer에 의해 elution 되어 농축된 sample이 가장 높은 독성을 가지는 것으로 나타내고 있다. 더 상세한 독성물질 정제를 위해 second anion-exchange chromatography (0.25 M KCl buffer에 의해 elution된 fraction)에서 얻어져 농축된 fraction을 gel filtration column이 사용된 HPLC에 가하였다. Fig. 2-A와 B는 HPLC 결과 및 각 peak에 대한 독성 test 결과를 보여준다. Fig. 2-A는 retention time이 47 min인 peak B가 가장 높은 독성을 가지는 것을 보여준다. 마지막으로 지금까지 설명한 anion-exchange와 gel filtration chromatography를 이용한 박테리아 배양액으로부터 정제된 독성물질의 분자량, 복잡성, 그리고 정체성을 알아보기 위해 FTIR-spectroscopy와 SDS-PAGE를 이용했다. FTIR-spectroscopy의 결과로 C=O stretching peak가 1650 cm-1에서 나타나 정제된 독성물질이 단백질로 확인되었다. Reducing SDS-PAGE 결과로 정제된 독성물질은 대략 39,000의 분자량을 가지는 단일 분자로 나타났다. 이 결과는 Bowen et al. [8]에 의해 정제된 독성 결과와는 대비된다. 그들은 곤충병원성 선충의 다른 공생 박테리아인 Phtorhabdus luminescens로부터 분자량 30,000에서 200,000 사이의 단백질 복합체인 독성물질을 정제했다. 그러므로 우리가 X. nematophilus의 배양액으로부터 정제한 독성물질은 친환경 생물학적 살충제의 개발 또는 살충 독성물질을 생산할 수 있는 유전 조작된 식물의 개발에 폭 넓은 기회를 제공하는 새로운 것이라 할 수 있다.

참고문헌

[1] Park, S.H. and D.W. Kim : Korean J. Biotechnol. Bioeng. 12(3): 261          (1997).

[2] Georgis, R. : Biocontrol Sci. Technol. 2: 83 (1992).

[3] Schmidt, T.M., Bleakley, B., and Nealson, K.H. : Appl. Env. Microbiol. 54

(11): 2793 (1988).

[4] Akhurst, R.J. : J. Gen. Microbiol. 121: 303 (1980).

[5] Wang, H. and B.C.A. Dowds : J. Bacteriol. 175(6): 1665 (1993).

[6] Smigielski, A.J., R.J. Akhurst, and N.E. Boemare : Appl. Environ.

Microbiol. 60: 120 (1994).

[7] Bowen, D., T.A. Rocheleau, M. Blackburn, O. Andreev, E. Golubeva, R.

Bhartia, and R.H. ffrench-Constant : Science 280: 2129 (1998).

[8] Park, S.H. and Y.S. Yu : Kor. J. Biotechnol. Bioeng. 14(2): 198 (1999).

[9] Park, S.H. and Y.S. Yu : Biotechnol. Bioprocess Eng. 4(1): 12 (1999).

[10] Laemmli, U.K. : Nature (London) 227: 680 (1970).

Fig. 1. Second anion-exchange chromatography of the growth supernatant of X. nematophilus on a DEAE Sephadex A-50 column. (A) Stepwise elution pattern by 0.22, 0.25, 0.27, and 0.30 M KCl buffers. The column was initially washed with 0.2 M KCl buffer. (B) Insecticidal toxicity of combined fractions eluted by each buffer of the same KCl concentration.

Fig. 2. HPLC of insecticidal toxin produced by X. nematophilus using a gel filtration column. (A) Elution pattern with peaks measured by absorbance at 220 nm. (B) Insecticidal toxicity of each peak.