에리스리톨 생산균주인 Moniliella suaveolens var. nigra의 wild type과

mutant의 거품생성원인 분석

조성주, 이상환, 박홍우

한양대학교 화학공학과

Analysis of foaming in erythritol fermentation with wild type

and mutant of Moniliella suaveolens var. nigra

Sungju Cho, Sangwhan Lee, Hongwoo Park

Department of Chemical Engineering, Hanyang University

서론

에리스리톨은 4탄당의 당알코올이여, 감미도가 설탕의 80% 정도이며 칼로리량이 설탕의 10% 미만으로 아주 낮고 충치를 유발하지 않으며, 청량감을 주며 가공하기 쉽고 다른 당알코올과 달리 배탈과 같은 부작용이 없기 때문에 아주 우수한 대체 감미료이다.  에리스리톨은 음료, 과자, 쵸코렛, 껌, 사탕, 유제품 등 저칼로리 및 비충치성을 원하는 제품에 다양하게 응용할 수 있다.  또한 고감도 감미료인 아스파탐이나 스테비아와 적당한 비율로 혼합할 경우 설탕의 맛과 유사한 감미도와 함께 저칼로리, 비충치성의 감미료를 만들 수 있다. 에리스리톨은 자이리톨, 솔비톨, 말티톨에 비해 특히 칼로리량이 아주 낮으며 가공성도 우수하기 때문에 상업적으로 충분한 경쟁력을 지니고 있다.[1,2,3]

에리스리톨을 생산하는 본 균주의 배양에서 다량의 거품의 발생하였다. 거품의 발생은 발생된 거품층에 세포가 갇혀 있으므로 세포성장이 저해되고 산소전달이 힘들기 때문에 에리스리톨의 생산수율이 떨어진다. 그 외에도 배양중에 발효기가 넘쳐서 배양 자체를 어렵게 만들 뿐아니라, 배양중에 오염의 원인이 된다.  거품은 교반과 통기에 의하여 기상과 액상의 경계면에 의하여 생성된다. 거품은 거품이 발생되는 양 뿐만 아니라 거품이 사그라들지 않고 오랫동안 유지되는 정도도 매우 중요하다. 발생된 후 금방 깨지는 거품을 froth라 표현하고 깨지지 않고 오랫동안 유지되는 거품을 foam이라고 한다. 많은 연구자들은 거품이 발생되는 부피(foaminess)와 발생된 거품의 안정성(foam stability)의 두 가지로 거품의 성질을 측정했다.[4]

발효에서 거품층의 생성은 단백질, 당, 당알코올, 깨진 세포, 지질, 유기산, 배지, 무기물 등이 복합적으로 작용하여 이루어지는 것으로 알려져 있다. 특히 단백질의 경우에 등전점의 범위에서 용해성이 떨어지므로 거품의 생성에 많은 영향을 보이는 것으로 알려져 있다.[4,5,6,7]

본 실험에서는 Moniliella suaveolens var. nigra의 wild type과 부산물인 글리세롤과 거품이 덜 생기도록 돌연변이된 mutant에서 거품이 발생하고 유지되는 원인으로 여겨지는 세포농도, 단백질농도, 지질 농도, 에리스리톨 및 글리세롤의 농도, pH, hydrophobicity에 대하여 조사하고 거품생성과의 관계를 분석하였다. 이 실험으로 얻은 wild type과 mutant의 거품 발생의 차이를 연구하여 거품억제 방안의 연구자료로 활용할 수 있을 것이다.

재료 및 방법

본 실험에서 사용된 미생물은 94년 본 연구실에서 screening에 의해 벌집에서 채취된 Moniliella suaveolens var. nigra의 wild type과 mutant이다.[8] Mutant는 NTG를 이용하여 wild type으로부터 얻어졌으며 부산물인 글리세롤생산량이 적고 거품의 발생이 적은 잇점을 가지고 잇다.

본 실험에서 사용한 시약은 효모 엑기스(yeast extract), 박토 펩톤(bacto peptone), 말트 엑기스(malt extract)는 Difco Co.(U.S.A)로부터 구입하였다. 포도당, 한천, 요소는 Junsei Co.(Japan)에서 구입하였다. 에리스리톨 등의 분석용 시약은 Sigma Co.(U.S.A)에서 구입하였다.

먼저 동결건조된 균주를 평판배지에 도말한 후 30℃, 5일간 항온배양기에서 배양하였다. 이중에서 잘자라는 균주를 사면배지에 접종시켰다. Erythritol 생산을 위한 종배양은 stock slant로부터 균주 1 백금이를 취하여 액체 배지 30 mL가 들어 있는 300 mL 진탕 플라스크에 접종하여 진탕배양기(Vision scientific Co., VS-8480SR)에서 240 rpm에서 3일간 배양하였다. 종배양에서 세포 농도가 10g/L일 때 5%를 접종하였다. 5L 발효기(한국발효기, KF-5L) 배양은 32℃, 1000rpm, air flow rate 1.0vvm (volume/volume/minute)을 기준으로 하여  1.2L의 액체배지에서 7일 동안 배양하였고, 매일 시료를 채취하였다.

세포농도는 분광광도계(Milton roy, spectronic 20D)로 562nm에서 OD를 측정하였다. 당분석은 유기산칼럼(Bio-rad, Aminex HPX-87H)을 사용하여 HPLC(Waters)로 분석하였다. 지질은 methanol과 chloroform을 이용한 추출에 의해 얻어지고 건조질량을 재어 측정했다. 단백질 농도의 측정은 Lowry 방법을 사용하였다. Hydrophobicity는 hexadecane의 소수성을 이용한 viable cell count방법을 이용했다.[9] pH는 corning사의 Ion analyzer 250을 사용하여 측정하였다. 거품층의 높이는 배양기의 옆에 표시되어 있는 L단위로 높이를 표시한 선에 기준하여 거품의 높이를 측정하였다. 거품의 안정성은 채취한 거품에 공기를 15초 동안 불어넣은 후 공기주입을 중지시켰을 때 거품이 반으로 줄어드는 시간을 측정했다.

결과 및 토론

Wild type의 거품분석 결과

Fig. 1(a)-(d)에 wild type균주를 배양한 후 배양 결과를 나타냈다. Fig. 1(a)에 거품높이와 거품의 stability를 나타냈다. 거품높이는 배양기 안에서 절대적인 거품의 부피를 나타내고 거품 안정성은 생성된 거품이 사그라드는 정도를 나타내며 거품이 사그라드는 시간이 오래 걸릴수록 거품의 안정성이 높다고 할 수 있다. 이는 거품방울의 크기와 밀접한 관련이 있었으며 거품방울이 작을수록 거품의 안정성이 높았다. 거품높이는 배양초기에 갑자기 증가하다 감소하는 경향을 보였다. 거품의 stability는 시간이 지날수록 점점 증가하는 경향을 보였다. Fig. 1(b)에 pH와 optical density의 변화를 나타냈다. 세포의 성장은 시간이 지나면서 급격히 증가하였으며 pH는 3일까지 급격히 떨어지다 약 3으로 고정되었다. Fig. 1(c)에는 단백질과 지질의 변화를 나타냈다. 단백질과 지질은 배양초기에 비해 점점 감소하는 경향을 보이지만 감소의 폭이 크지는 않았다. Fig. 1(d)에는 기질로 사용되는 포도당과 생산물인 에리스리톨, 글리세롤의 양의 변화량을 나타냈다. 실험결과 포도당과 에리스리톨, 글리세롤은 거품의 발생에 거의 영향을 끼치지 못하는 것으로 보인다.

거품을 분석한 factor를 가지고 분석한 결과 거품높이는 단백질과 관계가 있는 것으로 보인다. 그러나 단백질의 변화 곡선과 거품 높이의 변화와는 다르고 거품높이의 변화를 hydrophobicity를 나타내는 곡선과 흡사하다. 원래 hydrophobicity는 단백질에 비례하는 factor이지만 여기서는 기울기가 다르다. 그 이유는 pH의 변화 때문으로 보인다. 배양초기에 약 6.5였던 단백질의 pH가 배양말기에 약 3정도로 떨어지며 pH가 등전점에서 멀어지면 단백질이 극성을 띄기 때문에 용해도가 높아진다. 이 이유로 세포를 부유시켜 거품발생을 일으키는 hydrophobicity가 떨어지게 되며 거품발생이 적어진다. 이로서 거품의 높이는 단백질과 관계가 있다고 생각된다. 또한 추가로 pH조절 실험을 하면 이 관계를 명확히 할 수 잇을 것으로 기대된다. 거품의 안정성은 거품안의 세포의 농도와 관련이 있는 것으로 보인다. 깨진 세포나 소수성을 띄는 살아있는 세포가 거품막에 접착되어 거품이 잘 깨지지 않게 안정성을 높인다. 이는 세포를 제거한 거품이 거품안정성이 떨어지는 것으로 설명될 수 있으며(data not shown) Fig. 1에서도 거품의 세포농도와 거품안정성의 기울기가 비슷한 것으로 설명할 수 있다.

Mutant의 거품원인분석 결과

Fig. 2(a)-(d)에 mutant균주를 배양한 후 배양결과를  나타냈다. 배양결과의 경향은 wild type과 비슷했으나 단백질, 지질수치, OD, foam stability, 거품 높이의 경향은 약간 낮았다. 포도당의 소비속도와 에리스리톨의 생산속도는 wild type과 비슷했으나 글리세롤의 생산량은 wild type보다 훨씬 적었다. 거품의 높이가 낮은 것은 단백질이나 지질의 수치가 적기 때문인 것으로 보이며 foam의 안정성이 낮은 것은 거품에 있는 세포의 농도가 적기 때문으로 보인다. 거품높이의 경우 wild type은 1일에서 3일째에 급격히 떨어지는 경향을 보였고 mutant의 경우는 1일에서 3일째에 거의 비슷한 거품높이를 나타냈다. Wild type의 최고 거품높이는 약 3L였고 mutant의 최고 거품높이는 2.1L였다. 이는 mutant를 배양할 경우 같은 working volume에 대한 배양기의 부피가 wild type보다 적은 잇점이 있다.

거품을 분석한 factor를 가지고 분석한 결과 mutant도 거품높이가 단백질과 pH와 관계가 있었으며 거품안정성이 세포농도와 관계가 있었다. hydrophobicity를 나타내는 곡선과 거품높이를 나타내는 곡선이 흡사한 모양이며 hydrophobicity는 pH의 영향을 받아 배양 후반기에 급격히 적어진다. 거품안정성을 나타내는 곡선은 거품의 세포농도를 나타내는 곡선과 흡사했다.

미생물들의 거품요인은 미생물에 따라 거의 다 조금씩 틀리다. 그러나 이 실험을 통해 한 가지의 미생물은 그 미생물을 돌연변이시키더라도 생성되는 거품의 원인은 같다는 결론을 얻을 수 있었다.

참고문헌

1.R□per, H., J., Goossens, Starch/st□rke, 45, 400-405(1993)

2.Noda, K., T., Oku, American Institute of Nutrition, 122, 1266-1272 (1992)

3.Goossens, J., H., R□per, IFI NR. 1/2, 27-33 (1994)

4.Wongsamuth, R., P., Doran, Biotechnology and Bioengineering, 44, 481-488 (1994)

5.Gaden, E., Jr., V., Kevorkian, A Chemical Engineering Report, Octorber     (1956)

6.Bumbullis, W., K., Kalichewski, K., Sche□gerl, Applied Microbiology and      Biotechnology, 7, 147-154, (1979)

7.Noble, I., M., Collins, N., Porter, and J.,Varley, Biotechnology and              Bioengineering, 44, 801-807 (1994)

8.박지만, 박홍우, 한국생물공학회지, 13, 331-335

9.Ascon-cabrera, M., J., Lebeault, J of Ferment Bioeng, 80, 270-275 (1995)

Figure 1. Fermentation results of       Figure 2. Fermentation result of             wild type                                  mutant