저온 플라스마 공정을 이용한 헤파린 부착 스텐트의 제조

최 우 진, 정 명 호*, 조 동 련

전남대학교 응용화학과

Fabrication of Heparin Grafted Stent by Low Temperature

Plasma Process

Woo Jin Choi, Myung Ho Jeong*, Dong Lyun Cho

Faculty of Applied Chemical Engineering

Division of Cardiology Department of Internal Medicine*

Chonnam National University,

Kwangju 500-757, Korea

서론

스텐트 시술은 중재술의 초기에는 90% 이상의 성공률을 보이지만, 시술 후에 내막박리, 혈전 형성 등으로 인하여 급성 혈관폐쇠 합병증 및 재협착과 같은 만성합병증이 나타나고 있어 이에 대한 대책이 시급한 실정이다.1 현재 사용되고 있는 스텐트의 시술에서 나타나고 있는 상기의 문제점은 시술 상의 기술적 측면보다는 생적합성 및 치료제의 전달효능과 같은 스텐트 자체의 기능과 밀접한 관계를 맺고 있다. 현재 사용되고 있는 스텐트는 높은 강도 및 우수한 신축력의 요구조건 때문에 스텐레스 스틸 등의 금속을 slotted tube 또는 coil 형태로 만들어 제조하고 있는데, 이러한 금속들은 인체와의 생적합성이 좋지 않아 혈전이 쉽게 형성된다. 스텐트의  헤파린 부착능은 스텐트 소재의 내부 특성과는 상관없이 표면특성에 따라 결정되므로 스텐트의 표면을 화학적으로 개질시키면 향상시킬 수 있다. 본 실험에서는 저온 플라스마 공정을 이용한 박막코팅 방법을 이용하여 스텐트의 표면을 화학적으로 개질하여 헤파린을 grafting시켰다. 또한 이 실험은 스텐트에 헤파린을 grafting시키기 위한 전초 실험으로서 고가의 스텐트를 사용해야하는 단점을 보완하기 위해서 같은 재질의 stainless를 사용하여 실험을 했다.

실험

1. Stainless steel과 DACH(diaminocyclohexane)의 접착력 실험

우선 반응시간은 20분으로 고정시킨 다음 Power를 20, 40, 60W 로 바꾸어 가면서 반응시킨 후 결합력을 테잎테스트로 확인했다. 이 때 monomer의 평균유량은 0.8036 SCCM (25 mtorr/10sec) 정도였다. 다음에는 전처리를 한 후 똑같은 방법으로 테잎테스트를 실시했다.

2. 개질된 stainless steel에 헤파린 grafting

플라스마 공정을 이용한 stainless steel개질은 Fig.1에서 보이고 있는 tubular 반응기를 사용하였다. DACH 플라스마 처리된 스텐레스의 헤파린과의 grafting은 sodium citrate 22g을 증류수 1□에 넣어서 Ph 7의 sodium citrate solution 40ml를 만든다. 이 용액에 헤파린에 있는 COOH를 활성화시키기 위하여 수용성 카르보디이미드(Water Soluble Carbodiimide) 0.04g을 넣은 후 상온에서 30분간 활성화 시킨 다음 헤파린 0.05g를 녹인다. DACH로 처리된 스텐레스를 이 용액에 넣어 헤파린을 grafting하였으며 grafting 시간은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 시간까지 변화시켜 가면서 실시하였다. 안전성 확인은 30분 동안 증류수에 침지하여 세척 한 후 확인하였다.

Fig.1 Schematic diagram of tubular reactor

A : Vacuum pump     B : Sample     C : Sample holder

D : Vacuum chamber(4435[eqn: { cm}^{3 }])       E : Electrode

F : R.F generator      G : Pressure gauge H,I : Monomer

3. Stainless steel에 고정화된 헤파린의 정량

grafting된 헤파린의 양은 grafting하기 전과 후에 스텐레스의 무게변화량을 측정하였으며  FT-IR을 이용하여 헤파린이 grafting된 것을 확인했다. 또한 toluidin blue methord5를 이용하였다. 0.01N HCl용액 500ml에 toluidin blue 0.25g과 NaCl 1g (0.2%)을 녹여 0.005% toluidine blue solution을 제조하였다. 헤파린과 toluidine blue가 공존해 있을 때 헤파린의 농도와 착물을 형성하지 않은 toluidine blue의 흡광도와의 관계를 구하기 위해서 검정곡선을 작성한다. Stainless steel에 고정화된 헤파린을 정량하기 위해서 Stainless steel sample을 toluidine blue 용액 2ml와 0.2% NaCl 수용액 2ml를 섞은 용액에 30분동안 담구어 교반한 후 n-hexane 3ml를 넣어 격렬히 섞은 다음 수용액층에서 0.5ml를 취해서 메탄올 20ml와 혼합하여 622nm에서 흡광도를 측정하고 검정곡선으로부터 고정화 헤파린을 정량하였다.

결과 및 토론

Stainless steel과 DACH(diaminocyclohexane)의 접착력은 헤파린을 grafting시키기 위해서 중요하다. Stainless steel과 DACH의 결합력 측정은 테잎테스트로 실시했는데 반응시간은 20분으로 고정하고 Power를 20, 40, 60W로 변화시켜가면서 실시한 결과 40W가 최적 조건임을 알 수 있었다. 그리고 전처리 한 후의 결과가 상대적으로 좋은 결과를 나타냈다. 이것은 수소와 아르곤으로 표면을 충분히 cleaning시켰기 때문인 것으로 생각된다. 이 때 전처리 조건은 수소와 아르곤을 9.6439 SCCM (300 mtorr/10sec)과 3.2146 SCCM (100 mtorr/10sec)의 비로 고정하고 Power를 40W 5분 동안 반응시켰다. Stainless steel과 DACH의 결합력이 중요시 되는 이유는 헤파린에 있는 카르복실기(COOH)가 Stainless steel에 코팅된 DACH의 아민기와 반응이 잘 되었다고 가정할 지라도 근본적으로 stainless steel과 DACH의 결합력이 약하면 stainless steel에 약물 부착 효과를  기대하기가 어렵기 때문이다. Stainless steel에 DACH(diaminocyclohexane)플라스마 공정으로 처리하여 amino기를 도입하여 헤파린의 COOH기와 반응시켰다. 플라스마 중합은 10W에서 60W 까지, 반응시간을 5분에서 50분까지 변화시키면서 적정점을 찾았다. 저온 플라스마 공정은 기체 또는 유기 증기를 저압상태에 있는 반응기에 주입하면서 전기적 방전을 이용하여 플라스마 상태로 전환시킬 때 생성되는 방응종들을 이용하여 고체의 표면을 개질시키는 공정이다.2-3반응종들은 종류에 따라 고체 표면층의 분자들과 반응하여 고체 표면층의 물리, 화학적 변화를 초래하거나 서로 반응하면서 중합과정을 거쳐 고체 표면에 고분자 박막의 형태로 입혀진다. 이 공정은 건식공정이며, 개질의 폭이 넓고, 개질된 표면이 안정하며, 환경친화적이라는 장점들 때문에 여러 가지 목적의 표면 개질에 널리 애용되어 가고 있다.4 특히 각종 소재들의 생적합성 향상 및 기능성 향상에 매우 적합한 공정으로 평가받고 있다. DACH 플라스마 처리의 적정 조건은 물 접촉각을 측정한 결과 20W 20분에서 처리하였을 때 세척한 후 가장 낮은 접촉각을 보였으나 실제 접착력은 40W 20분에서 좋았다. 헤파린은 3시간 동안 grafting하였을 때 가장 많은 양의 헤파린이 grafting 된 것을 확인하였다(Fig.2). 30분 동안 증류수에 침지하여 세척을 하였을 때는 헤파린이 거의 모두 떨어져 나가는 것을 통하여 Stainless steel 표면에 DACH 플라스마가 안정적으로 처리되지 않은 것을 알 수 있었다(Fig.3). (Fig.5) 는 DACH로 처리한 후와 Heparin을 그래프팅 시킨 후에 FT-IR을 찍은 것인데 FT-IR 분석을 한 결과 1657[eqn: { cm}^{-1 }] 부근에서 amide의 C=O stretching peak와 1590[eqn: { cm}^{-1 }]부근에서 NH deformation peak를 확인함으로 헤파린의 COOH 와 DACH 처리된 Stainless steel이 아민기와 grafting된 것을 확인할 수 있었다. 또한 Toluidin blue방법으로도 확인할 수 있었다. Toluidin blue는 산성에서 헤파린과 착물을 형성하므로 헤파린과 반응하지 않은 toluidine blue의 농도를 측정함으로써 헤파린과 반응한 toluidin blue의 농도를 알 수 있었다. Toluidine blue의 흡광도는 헤파린의 양이 많을수록 감소하게 되는데, 이것은 toluidine blue와 헤파린의 반응으로 toluidine blue의 양이 감소하게 되어 흡광도는 감소하게 된다. Fig.4 에서 보는 바와 같이 검정곡선을 그린 다음 최소자승법으로 직선의 방정식을 구한다. 직선의 방정식에서 [eqn: y]값 즉 absorbance를 알고 있기 때문에 [eqn: x]값, 즉 헤파린의 양을 계산할 수가 있다. Fig.4에서의 직선의 방정식은 [eqn: y=-0.0011x + 0.9575]이었다. 시편 2개를 DACH 플라스마로 처리한 후 헤파린을 grafting시킨 다음 24시간 이상 건조시켰다. 건조 후하나는 증류수에 30초 동안 세척한 다음 흡광도를 측정했다. 세척 한 시편의 흡광도는 0.858이였고 세척을 하지 않은 시편의 흡광도는 0.855이였다. 이 값들을 위의 방정식에 대입하여 계산한 값은 각각 [eqn: 91.3636 TIMES { 10}^{-6}] , [eqn: 93.1818 TIMES { 10}^{-6}]g이였다.

Fig.2 Plot of amount of grafted heparin v.s.         Fig.3 Plot of amount of grafted heparin v.s.                      grafting time                                               grafting time(after washing)

Fig.4 UV absorbance of residual toluidine blue at 622 nm as a function of the concentration of heparin in 0.2%        NaCl aqueous solution

Fig. 5 FT-IR/ATR spectra of DACH(…) and Heparin(―) grafted stainless steel

감사의 글

본 연구는 보건복지부 □98년도 보건의료기술연구개발사업 연구비의 지원을 받아 수행된 연구 결과임.

참고문헌

1. Jeong MII, Cho IJ, Seo JP, Ryu MH, Lee MG, Park JS, Ahn YK, Gill GC, Park JC, Kang JC. Predictive factors of restenosis after percutaneous coronary agnioplasty. The Korean Circulation Journal. 1994;24:762-768

2. Yasuda H. Plasma Polymerization, Orlando, Academic Press; 1985

3. Boenig H. Fundamentals of Plasma Chemistry and Technology, Lancaster, Technomic; 1988

4. Cho DL, Yasuda H. Tribological application of plasma polymers. J Appl Polym Sci. 1988; 42:139-156

5. P. K. Smith, A. K. Mallia, and G. T. Hermanson, Anal. Biochem, 109,466 (1980)