Poly(DL-lactide-co-glycolide) Microspheres의 약물방출 거동

나재운, 차월석*, 이동병*

순천대학교 공과대학 고분자공학과, 조선대학교 공과대학 화학공학과*

Released Drug Behavior of Poly(DL-lactide-co-glycolide) Microspheres

Jae-Woon Nah, Wol-Suk Cha*, Dong-Byung Lee*

Dept. of Polymer Sci. and Eng., Sunchon Nat'l Univ., Chonnam 540-742, Korea

*Dept. of Chem. Eng., Chosun Univ., Kwangju 501-759, Korea

1. 서 론

IMP 및 허약한 경제실정이 해외시장에 노출된 현 시점에 이를 극복하기 위한 다각적인 노력이 모색되어야 할 시점에 와 있다. 그 중에 제약산업이 고부가가치를 창조하는 첨단산업임에도 불구하고 국내에서는 매우 취약한 상태에 있으며, 우리의 경제성, 개발 시스템, 판매능력 등의 한계를 고려할 때 새로운 의약개발은 상당히 어려운 일이라고 하겠다. 따라서 이미 안전성과 효력이 입증되거나 약물의 장단점이 파악된 약물을 사용하고 독성으로 인하여 개발중도에 포기해야 할 확률이 적은 약물전달시스템(drug delivery system, DDS)의 개발은 매우 그 전망이 밝다. 특히 DDS에서 약물전달체로 가장 많이 사용하고 있는 polyester계통의 생체분해성 고분자인 poly(lactic acid)(PLA), poly(glycolic acid)(PGA) 및 poly(DL-lactide-co-glycolide)(DL-PLG)의  DDS의 응용은 경제성, 독성 등의 여러 가지 측면에서 유리한 측면을 내재하고있다.[1,2]

향정신성 의약품인 benzodiazepam계 약물은 장기간 복용 및  약물의 과잉투여는 인체에 심각한 문제점들을 야기시키고 있다. 이에 따라 보건당국은 약물의 오용으로 인한 약물의 의존성을 막기 위해 법적인 대책을 모색하고 있으나 특별한 대책없이 benzodiazepam계 약물이 통상적인 치료제로 여전히 남아있다. 따라서 적당량의 투여와 장시간에 걸쳐 유효혈중농도를 유지시키는 효율적인 치료가 절실히 요구되고 있다[3].

본 연구에서는 DL-lactic acid와 glycolic acid에 촉매 Sb2O3을 사용하여 환상(cyclic diester)의 DL-lactide와 glycolide를 합성하였다. 이들 monomer로부터 poly(DL-lactide-co-glycolide)(70:30, 80:20, 90:10) 공중합체를 합성[4]하고 공중합체만의 미소구체을 제조하여 그 특성을 파악한 다음 공중합체와 약물의 비를 3:1로 하여 미소구체을 제조하여 DDS 제제로의 그 응용 가능성을 고찰하였다.

2. 실 험

2.1. 시약 및 기기

Glycolic acid(70wt.%), DL-lactic acid(85wt.%), 등은 Aldrich Chem. Co.의 특급시약을, stannous octoate(95%)는 Sigma Chem. Co.의 특급시약을, antimony trioxide은 Junsei Chem. Co.의 1급시약을 사용하였다. 기기로는 NMR spectro- photometer(Bruker AC-300F, 300MHz), DSC(Mettler Co. DSC 30), GPC column(Shimazu GPC-800series)등을 사용하였다.

2.2. 합성방법[4]

GA 100 g과 Sb2O3 1.1 g을 삼구플라스크에 넣고 질소기류하에서 120 ℃로 2 시간동안 탈수반응시킨 후 온도를 180 ℃까지 높이고 5 mmHg에서 6 시간 반응시켰다. 그 다음 반응기내의 온도는 250-260 ℃, 5 mmHg에서 반응시켜 연한 노란색의 부산물을 포함하고 있는 glycolide를 얻었다. 생성물을 chloroform과 ethyl acetate로 재결정한 다음 동결건조하여 순수한 백색의 glycolide를 얻었다. DL-Lactide의 경우도 glycolide와 동일한 방법으로 순수한 백색의 DL-lactide를 얻었다. DL-Lactide 7.0 g, glycolide 3.0 g, lauryl alcohol 0.1 g 및 stannous octoate 0.3 g을 삼구플라스크에 넣고 질소기류하에서 200 ℃로 하여 4 시간 동안 반응시켰다. 얻어진 생성물을 ethyl acetate-petroleum ether 혼합용매에서 추출한 후 동결건조하여 DL-lactide와 glycolide가 70:30로 합성된 DL-PLG(70:30)를 얻었다. DL-PLG(80:20) 및 DL-PLG(90:10)도 동일한 방법으로 합성하였다.

2.3. 미소구체의 제조

DL-PLG(70:30) 60 mg과 소수성 약물인 clonazepam 20 mg을 실온에서 DMF 4 mL에 용해시켰다. 이 약물이 녹아 있는 고분자용액을 cellulose tube에서 증류수에 침지시켜 24 시간 동안 투석한 후 동결건조하여 DL-PLG(70:30)와 약물의 무게비가 60:20 (mg)인 미색의 미소구체 7331을 얻었다. 미소구체 8231 및 미소구체 9131도 동일한 방법을 사용하였고 전달약물을 함유하지 않은 경우에도 동일한 방법으로 미소구체를 제조하였다.

2.3. 약물방출 실험

미소구체 4 mg을 37.0±0.05 ℃의 조건으로 pH 7.4 phosphate buffer solution (PBS)에서 100 rpm의 속도로 교반시켜 방출실험을 하였다. 미소구체로부터 방출된 clonazepam을 포함하고 있는 PBS 방출액은 일정한 시간마다 취하고 즉시 새로운 동량의 PBS를 넣어 동일한 조건으로 유지시켰다. 채취된 시료는 millipore filter (pore size 0.2 □)를 통과시킨 후 UV-spectrophotometer를 이용하여 최대 흡수파장 306 nm에서 PBS를 대조로 하여 그 흡광도를 측정하였으며, 미리 작성된 검량선으로부터 방출된 약물을 정량하였다. 방출량은 3회 이상 실험을 실시하여 얻은 평균치를 사용하였다. 미소구체의 약물함유량 측정 방법은 먼저 미소구체 10 mg이 녹아 있는 CH2Cl2 5 mL에 과량의 메탄올로 종합체를 침전시켰다. 침전된 중합체를 여과제거한 후 메탄올을 증발시켜 약물만 용해되어 있는 용액 10 mL를 만들었다. 이 용액을 UV-spectrophotometer로 최대 흡수파장 306nm에서 그 흡광도를 측정하였으며 검량선으로부터 loading된 약물을 정량하여 약물의 loading양을 계산하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 Monomer와 공중합체의 구조확인

합성된 이량체의 FT-NMR spectra를 확인한 결과 DL-lactide는 1H-NMR [(CDCl3):□(ppm)=1.66-1.69(3H,-CH3), 5.03-5.10(1H,≡CH)], 13C-NMR[(CDCl3):□(ppm)=15.80(CH3), 72.25(C,≡CH), 167.75(C,-CH-(C=O)O-)], glycolide는1H-NMR [(DMSO-d6):□(ppm)=5.05(2H,=CH2)], 13C-NMR[(DMSO-d6):□(ppm)=65.46(C,=CH2), 165.48(C,-CH2-(C=O)-O-)]이었다. DL-PLG(70:30) 공중합체의 경우는 1H-NMR spectrum 수소면적비가 -CH3에 의해 1.55-1.69ppm 부근에서 나타난 흡수피크와 =CH2에 의해 4.67-4.91 ppm  부근에서 나타난 흡수피크가 70:30의 비율을 보였고, 13C-NMR은 □(ppm)=16.65(C,-CH3),  60.64-60.79(C,=CH2), 68.98- 69.15(C,≡CH), 166.34(C,-CH2-(C=O)O-), 169.32(C,-CH-(C=O)O-), DL-PLG(80:20) 공중합체는 1H-NMR spectrum 수소면적비가  -CH3에 의해 1.55-1.61 ppm 부근에서 나타난  흡수피크와 =CH2에 의해 4.72-4.87 ppm 부근에서 나타난  흡수피크가 80:20의 비율을 보였으며, 13C-NMR은 □(ppm)=16.67(C,-CH3), 60.80(C,=CH2)

68.99-69.17(C,≡CH),  166.43(C,-CH2-(C=O)O-), 169.31(C,-CH-(C=O)O-)이었다.

DL-PLG(90:10) 공중합체는 1H-NMR spectrum 수소면적비가 -CH3에 의해 1.55-1.60ppm 부근에서 나타난  흡수피크와 =CH2에 의해 4.66-4.87 ppm 부근에서 나타난  흡수피크가 90:10의 비율을 보였으며, 13C-NMR은□(ppm)=16.64- 16.72(C,-CH3), 60.64-60.84(C,=CH2), 68.98-69.16(≡CH),  166.42(C,-CH2-(C=O)O-),

169.15-169.59(C,-CH-(C=O)O-)을 보여 합성을 확인할 수 있었다.

3.2.  물리적 특성

DL-LA 및 GA로부터 합성된 DL-lactide, glycolide,  및 DL-PLG(70:30, 80:20, 90:10)의 물리적 특성은 Table 1과 같다. 고유점도[□]는 DL-PLG(70:30, 80:20, 90:10)을 chloroform에 각각 녹여 Ubbelohde, 평균분자량(Mw) 측정은 THF 용매에 녹여 GPC column을 사용하였다. 또한 유리전이온도 및 녹는점은 승온속도를 1분당 10℃의 조건으로 DSC를 측정하였다. DL-lactide와 glycolide의 공중합체 DL-PLG는 chloroform, methylene chloride 등에 용해되나  PGA는 용해되지 않는 것으로 보고[7,8]되고 있다. 용매조사를 한 결과 공중합체인 DL-PLG가 CHCl3 및 CH2Cl2에 녹는 것으로 보아 단순히 DL-PLA와 PGA의 혼합물이 아님을 알 수 있다.

Table 1. Properties of DL-lactide, glycolide, and DL-PLG(70:30, 80:20,

90:10) in inherent viscosity, average molecular weight, and

glass transition temperature

Monomer/polymer	a) [□]	b) Mw	c) Tg(℃)	c) Tm(℃)
DL-lactide Glycolide DL-PLG(70:30) DL-PLG(80:20) DL-PLG(90:10)	1.246 1.095 1.221	127,000 112,000 124,000	57.4 58.6 62.1	98 83

a) Measured by Ubbelohde viscometer, solvent:CHCl3,

concentration: 0.2g/□, temperature: 25℃.

b) Measured by GPC, solvent:THF, con.: 0.01□/□.

c) Measured by DSC, heating rate:10℃/min.

3.3.  미소구체의 제조확인 및 특성

미소구체의 형태를 관찰하기 위해서 SEM으로 확인한 결과, 약물이 함유되어 있지 않은 미소구체(73, 82, 91)의 경우에는 0.3-0.5 □의 직경을 갖는 미소구체가 주종을 이루었으며, 최대의 크기는 직경이 3.5 □를 보였다. 미소구체(7331, 8231, 9131)의 경우에 크기는 소수성 고분자의 함유량이 증가함에 따라 커지는 경향이 있으나 직경이 0.5-1.5□로 대체로 균일한 크기를 보였다. 미소구체가  고분자의 소수성 부분에 약물을 함유하므로 미소구체의 크기가 증가하는 것으로 사료된다.

또한 미소구체 내부에 있는 Clonazepam의 분해온도는 240 ℃인데 230 ℃이하로 떨어지는 경향을 보이는데 이는 소수성 고분자와 interaction이 영향을 미치게 되기 때문으로 생각된다.

3.4.  약물방출 특성

미소구체(7331, 8231, 9131)의 약물함유량 무게 퍼센트는 각각 34.45, 33.95, 31.22 (%)로 친수성인 glycolide 단위가 증가할수록 소수성 약물함유량이 증가하는 경향을 보이는데 이것은 미소구체 형성시 적당한 친수성과 소수성 비율은 보다 안정적인 미소구체를 이루고 따라서 약물함유량이 증가하는 것으로 생각된다.

본 실험에서 DL-PLG는 균일분해가 일어난다. 즉 미소구체가 전체적으로 균일하게 수화, 팽윤, 절단의 단계가 진행된다. 따라서 약물은 표면침식보다는 확산에 의해 방출되는 거동을 보인다. 미소구체 7331으로부터 소수성 약물이 선형적으로 방출이 지연되는 시간범위는 29 일이고 미소구체 8231과 9131인 경우는 각각 27 일, 29 일의 지연시간을 보였다. 그러나 방출 지연되는 방출량의 순서는 미소구체7331, 미소구체8231, 미소구체9131의 순서로 나타났다. 따라서 미소구체 제조시에 보다 안정적인 미소구체를 형성할 가능성있는 미소구체 7331가 가장 약물방출 지연성이 좋고 그다음이 미소구체 8231, 미소구체 9131순으로 약물방출 거동을 보였다.

4. 결 론

미소구체로부터 약물이 선형적으로 방출지연된 시간범위는 미소구체 7331인 경우가 29 일이고, 미소구체 8231과 9131인 경우는 각각 27 일, 20 일로 미소구체 제조시 친수성과 소수성 고분자가 보다 안정적인 미소구체를 형성할 수 있는 경우일수록 약물방출 제어시간이 증가함을 알 수 있었다. 또한 약물이 함유하지 않은 경우보다 함유한 경우가 미소구체의 크기가 증가하는데 이는 미소구체 내의 소수성부분에 약물이 함유되어 있는 경우로 사료된다. 결과적으로 diafiltration법에 의한 미소구체 제조는 균일한 크기를 갖으며 초기의 과잉방출을 억하여 약물의 방출거동을 제어할 수 있는 미소구체의 제조가 가능해 정맥주사용 DDS 제제로 그 응용이 기대된다.

5. 참고문헌

1. Khosla, R. and Davis, S. S.: Int. J. Pharm., 52, 1(1989).

2. Lee, H. K.: Biotech. News, 10, 37(1996).

3. Fryer, R. I.: In Comprehensive Medicinal Chemistry, Pergamon Press:

British, 3, 539(1990).

4. Reed, A. M. and Gilding, D. K.: Polymer, 20, 1459(1979).

5. Holland, S. J. and Tighe, B. J.: Gould, P. L. J. Controlled Release, 4, 155

(1986).

6. Cho, C. S.; Nah, J. W Jeong, Y. I.,  Kim, S. H., Lee, Y. M., and

Sung, Y. K.: Polymer(Korea), 19, 926(1995).

7. Lee, H. K., Kwon, O., Park, J., and kim, H.: Proceed. 20th  Inter. Symp.

on Controlled Release Bio. Mater., Washington. D. C. July, 25-30, 500(1993).

8.  Middaugh, C. R.: Drug Developments and Industrial Pharm., 16, 2635(1990).